ДНК репликация. Репликационни ензими. Биологичната роля на репликацията. Регулиране на репликацията на ДНК Механизми за регулиране на репликацията на нуклеинова киселина

Подробното разглеждане на молекулярните механизми на регулиране на репликацията на ДНК е извън обхвата на книгата, затова ще се ограничим до няколко коментара по този въпрос и ще обсъдим по-подробно само механизма на регулиране на репликацията в E. coli, включително бактериални плазмиди, което е пряко свързано с функционирането на плазмидни вектори в бактериалните клетки.

Синтезът на ДНК е тясно свързан с други процеси, които подготвят клетъчното делене, тъй като прехвърлянето на необходимата генетична информация от родителските клетки към дъщерните клетки е жизненоважно за клетките на потомството. Наличието на излишна генетична информация се отразява негативно на жизнеспособността на клетките, докато нейната липса, която възниква в резултат на недостатъчна репликация на ДНК, води до летален ефект поради липсата на жизненоважни гени. Въпреки това, процесът на трансфер на генетична информация от родителски клетки към дъщерни клетки в еукариотите не се ограничава до проста репликация на ДНК на хромозоми. Така че, за насекоми от много видове, наличието на гигант политическихромозоми, които възникват в резултат на множество кръгове на репликация на ДНК на оригиналните хроматиди, които не са придружени от тяхната дивергенция.

Политенизацияхромозомите представляват широк клас генетични явления, свързани със селективно свръхрепликация ( анимация) или недостатъчно възпроизвеждане на отделни генетични локуси на еукариоти. Ярък пример от този вид е промяната в броя на рибозомните РНК гени при животните. Амплификацията на rRNA гените в ооцитите на земноводни става чрез образуването на техните екстрахромозомни (екстрахромозомни) копия под формата на кръгови рибозомни (p) ДНК молекули, които след това се репликират чрез механизма на "търкалящ се пръстен". В този случай само един от стотиците повторения на рДНК се амплифицира във всяка клетка, така че амплификацията на рДНК при едно повторение по някакъв начин потиска процеса на амплификация на други и всички получени повторения на един ооцит са идентични, но се различават от наборите на амплифицирани рДНК на други ооцити. Строгата стадийна и тъканна специфичност, както и селективното амплифициране само на едно повторение на рДНК, също показват наличието на фини регулаторни механизми на процеса на репликация и в този случай.

Типични примери за увеличаване на броя на гените поради тяхната селективна репликация са увеличение rRNA гени и промени в броя на гените, които определят резистентността на клетките към лекарства. В първия случай загубата на някои от rRNA гените в Drosophila в резултат на делеция е придружена от постепенно възстановяване на техния брой, докато във втория случай броят на генните копия, необходими за нейната неутрализация, се увеличава в клетките под селективно действие на токсично за тях лекарство. По-специално, това е характерно за гена на дихидрофолат редуктазата в присъствието на метотрексат. Предполага се, че промяната в броя на копията на такива гени се основава на механизма на неравномерно кръстосване.

Репликацията на бактериалните хромозоми е тясно свързана с клетъчния метаболизъм. Например, честотата на иницииране на нови кръгове на репликация зависи от скоростта на растеж на бактериалните клетки, а клетките на бързо растящи бактерии могат да съдържат хромозоми с няколко работещи репликативни вилици, въпреки че само две от тях са необходими за репликиране на една бактериална хромозома, инициирана в единичен произход на репликация (ori) и разминаване в противоположни посоки. Това позволява на бактериите, при благоприятни условия, да прекарват по-малко време за генериране, отколкото за пълна репликация на бактериална хромозома. Очевидно, за да се поддържа строго подреден характер на репликацията, трябва да има фини механизми за регулиране на репликацията на нивото на иницииране на нови кръгове. Такива механизми съществуват.

Понастоящем най-добре проучените механизми за регулиране на синтеза на ДНК в E. coli, включително механизмите за контрол на броя на копията в малкия плазмид на E. coli ColE1, които ще бъдат разгледани по-долу по-подробно поради важността на тези явления за генното инженерство.

Репликацията се случва, след като клетката премине точката на рестрикция или START

Репликацията се регулира на етапи и се координира с началото на митозата

Репликацията се случва в точки на иницииране, които могат да имат специална първична структура, специфична позиция или да бъдат разположени в ДНК на определени разстояния

Инициирането се извършва само в оторизирани точки, които са способни за репликация

След като са изпълнили функциите си, преди следващия цикъл началните точки на репликация не могат да бъдат използвани повторно.

Кога клеткианализира състоянието заобикаляща средаи взеха решението да влязат в цикъла на делене, те преминават точката G1 / S и започват репликацията на ДНК. Как клетките комбинират и активират факторите, необходими за репликацията на ДНК? Какви механизми за контрол гарантират, че клетката репликира ДНК само веднъж и само веднъж в цикъл?

Въпреки че все още не е възможно да се дадат пълни отговори на тези въпроси въпроси, в резултат на идентифицирането и анализа на последователността на дрождовата хромозомна ДНК, способна на независима репликация, е получена много информация за самия процес на репликация на ДНК. Тези последователности в хромозомата, наречени автономно репликиращи се последователности (ARS), са част от произхода на репликацията. Точката на иницииране или начало (произход на репликация) е областта на ДНК последователността, в която започва репликацията.

В пъпещи дрожди, но не и в повечето други организми, произходът на репликацията е представен от малки консенсусни последователности. При сливането на дрожди тези точки заемат големи области на ДНК, богати на двойки кръвно налягане, но не се различават по някаква специална структура. При други еукариоти произходът на репликацията е разположен произволно, в съответствие с разпределението на протеини, неспецифично свързани с ДНК в целия геном.

За да се гарантира навременно удвояване на генома, трябва да има достатъчен брой източници на репликация в хромозомата. При бактериите репликацията на една кръгла хромозома изисква само един произход, но еукариотите с голям геном, разпределен в много линейни хромозоми, трябва да имат много произход на репликация. В пъпкуващите дрожди, чийто размер на генома е около 13 Mb, има около 400 произхода на репликация в 16 хромозоми.

Това създава няколко проблема, свързани с регулиране на процеса на репликация... Функционирането на точките на произход на репликацията трябва да бъде координирано с клетъчния цикъл по такъв начин, че репликацията да започне само по време на S фазата. Трябва да има пълна увереност, че репликацията е завършена, преди клетката да влезе в митоза. Всяка от точките на произход на репликацията трябва да функционира само веднъж, за да се гарантира, че ДНК се репликира само веднъж на цикъл.

През целия клетъчен цикъл 0RC е свързан с произхода на репликацията в хромозомата.
През кратък период от време, от късна митоза до G1, протеините, които активират репликацията, също се свързват с началната точка,
Cdc6 и Cdt1, което от своя страна активира хексамерния MSM хеликазен комплекс (MCM2-7).
Тази стъпка завършва премахването на репликационния блок и сглобяването на пред-RC.

Начални точки репликациясвързват факторите, необходими за активиране на репликацията и иницииране на синтеза на ДНК. Започването на репликация на ДНК се случва само в онези точки, които съдържат свързани фактори и следователно се считат за разрешени точки. Въпреки това, във всеки кръг на репликация на ДНК, ограничен набор от потенциални изходни точки, присъстващи в хромозомите, участват в процеса. Освен това, тъй като различни разрешени начални точки се активират по различно време, задействащите събития също се появяват на различни интервали. Например, някои точки се активират в ранната S-фаза, докато други преминават в това състояние по-късно.

Не се знае какво е това фактор време, но изглежда, че местоположението на специфичен произход на репликация в хромозомата определя времето на нейното начало.

За да започне репликацията, в началната точка, a предрепликативен комплекс(преди RC). В резултат на генетични изследвания върху дрожди и биохимични експерименти върху екстракти от ооцити на Xenopus, беше разкрита картината на пред-RC сглобяване. Процесът започва със свързването към ДНК на комплекс от шест протеина, който се нарича комплекс за разпознаване на произход (ORC). Този комплекс бележи потенциална начална точка за репликация, но не е достатъчен за активиране. Той служи като платформа за свързване на още два запазени протеина: Cdc6, който принадлежи към семейството на AAA + ATPase, и Cdt1. (Много протеини с ATPase домейн използват енергията на ATP, за да вършат работата си.)

След това към тях се присъединява комплекс поддържаща минихромозома(комплекс за поддържане на минихромозоми, MSM), който е пръстенна структура, състояща се от шест свързани протеина, които също принадлежат към голямото семейство AAA + АТФази. MSM комплексите присъстват в изобилие и се разпространяват отвъд точката на произход на репликацията. След прикачване на MSM, ORC и Cdc6 стават незадължителни компоненти и pre-RC преминава в състояние, което може да бъде активирано. Редът на събитията по време на пред-RC изграждане в началото на репликацията е показан схематично на фигурата по-долу.

Пред-RC монтажограничен от интервала между края на М-фазата и ранната S-фаза, което се обяснява със следните причини. Първо, нивото на протеина Cdc6 в клетката се контролира по такъв начин, че да присъства само през този период от време. В отсъствието на протеин Cdc6, MSM протеинът не се свързва с произхода на репликацията. Второ, при Metazoa протеинът Cdt1 се регулира отрицателно от друг протеин, геминин, който блокира неговата активност през всички периоди с изключение на прозореца G1. И накрая, самото сглобяване на pre-RC е ограничено от активността на митотичния CDK-циклинов комплекс.

Субстратите за този комплекс са субединици ORC, CDc6и МСМ... При фосфорилиране Cdc6 се инактивира, а фосфорилирането на MSM протеина в S-фазата причинява неговото отцепване от ДНК. Следователно, pre-RC може да се образува само при ниска активност на CDK-циклиновия комплекс. Това е типично за интервала между нивата на висока активност на митотичния комплекс CDK-циклин в М-фазата и в S-фазата, когато тя се увеличава отново, насърчавайки активирането на произхода на репликацията.

Как е смисълът стартиране на репликацияпреминава от предрепликативно в репликативно състояние? Този преход изисква образуването на много допълнителни протеинови комплекси и процесът е под контрола на две кинази, CDK-циклиновия комплекс и Cdc7-Dbf4 (DDK). По този начин активността на CDK-циклиновия комплекс координира процесите на репликация и клетъчния цикъл. В същото време координацията може да бъде или отрицателна (предотвратяване на сглобяването преди RC и по този начин повторното функциониране на началните точки на репликацията), и положителен характер(насърчаване на активирането на началните точки на репликация). Сред въпросите, които очакват отговор, е въпросът за киназните субстрати, които насърчават инициирането на репликация.

Ако комплексите CDK-циклиносигуряват координацията на процесите през целия цикъл, след което DDK действа на ниво отделни точки, които инициират синтеза на ДНК. Най-известните субстрати на тази киназа са самите MSM протеини. Интересното е, че точкова мутация в гена Mcm5 премахва необходимостта от DDK. Това предполага, че фосфорилирането води до промяна в структурата на MSM протеина, което е причината за започване на репликация. Наличните данни обаче показват, че тези промени са изключително незначителни. Показани са контролните процеси на репликация на ДНК, включващи CDK и DDK.

Вероятно ограничаващият процес на иницииране репликацияв отделни изходни точки е свързването на протеина Cdc45, което изисква както CDK-циклиновия комплекс, така и DDK. Свързването на този протеин, което е придружено от образуването на допълнителен комплекс, наречен GINS, води до развиване на спиралата на ДНК в началната точка, поради активирането на MSM комплекса, който действа като хеликаза. По този начин МСМ се превръща от сглобяващ фактор, участващ в образуването на пре-RC в ензима хеликаза, който е част от комплекса за удължаване. Развиването на двойната спирала на ДНК в началото на репликацията води до образуването на едноверижна ДНК, която свързва специфичен RPA протеин, който принадлежи към групата протеини, които се свързват с едноверижна ДНК (ssDNA свързващи протеини).

на свой ред, RPA протеиннасърчава свързването на комплекса примаза/ДНК полимераза алфа, което инициира синтеза на ДНК. Комплексът от MSM и Cdc45 се движи по протежение на ДНК, образувайки разширяваща се репликативна вилка, която образува голям реплицизом, който включва главно ДНК полимераза 6, а не полимераза а. Процесите на иницииране на репликация на ДНК са показани на фигурата по-долу. Контролните точки и системите за възстановяване на ДНК участват в поддържането на функционирането на реплицизома и защитата на ДНК в областта на репликативната вилица от увреждане.

Веднъж МСМотдалечен от началната точка на репликация, той се счита за "използван" и не може да бъде активиран отново до края на следващата М-фаза, докато пред-RC не се формира отново в началната точка. С напредването на S-фазата MSM се отстраняват от хроматина. Заедно с това по време на движението на репликативната вилка се установяват връзки, които свързват новообразуваните сестрински хроматиди преди началото на митозата. По този начин завършването на S-фазата е свързано с образуването на структури, необходими за правилната сегрегация на хромозомите в митозата, което показва образуването на връзки между различните фази на клетъчния цикъл.

Функцията за начало на репликация също се регулира на ниво цяло число. хромозоми... Препоръчително е да припомним, че в клетката, с помощта на нуклеозоми, тя е опакована в хроматин, което налага редица структурни ограничения върху нея. Това обстоятелство може да повлияе на временната организация на репликацията; например, не всички начални точки на S-фаза се репликират по едно и също време. В някои случаи относителното време на началото на активиране на точките на произход на репликацията може да се определи не от самата точка, а от нейното местоположение в хромозомата. Точките, разположени близо до транскрипционно активния еухроматин, се инициират по-рано от тези, разположени близо до транскрипционно неактивния хетерохроматин, които обикновено се инициират в късната S фаза.

Лекция 3. Репликация на различни ДНК и нейното регулиране и възстановяване

Уотсън и Крик предположиха, че за да се случи удвояване на ДНК, трябва да настъпят водородните връзки, държащи спиралния дуплекс заедно, и разделянето на нишките. Те също така предполагат, че всяка верига на дуплекса служи като шаблон за синтеза на комплементарна верига и в резултат се образуват две двойки нишки, във всяка от които само една е родителската. Уотсън и Крик предположиха, че репликацията на ДНК става спонтанно, без участието на ензими, но това се оказа невярно. Независимо от това, идеята, че дублирането на ДНК се случва чрез последователно свързване на нуклеотиди в съответствие с правилото за допълване, дадено от всяка верига на спиралата, е решила концептуалния проблем за точното възпроизвеждане на гени.

Тъй като е направено това предположение, матричната природа на механизма на репликация е потвърдена от множество данни, получени както in vitro, така и in vivo за различни организми. Според модела, репликацията на цялата двуверижна ДНК е полуконсервирана. Доказателство за полуконсервативен механизъм е получено през 1958 г. от учените Мезелсън и Стал (д). Първо, те отглеждат бактерии за дълго време в среда, съдържаща тежък азотен изотоп (15 N), който е включен в ДНК, и след това ги прехвърлят в среда, съдържаща общ лек азотен изотоп (14 N). След репликацията дъщерната ДНК от първо поколение беше фракционирана по плътност. Оказа се, че цялата дъщерна ДНК е хомогенна и има плътност, междинна между плътността на тежката и леката ДНК. Следователно едната верига от дъщерната ДНК молекула съдържа 15 N, а другата 14 N, което съответства на полуконсервативния механизъм. Не е известно дали съществуват алтернативни начини за репликация на двуверижна ДНК (консервативна и диспергирана) по природа. И така, след един кръг на репликация, една верига във всяка от двете дъщерни ДНК е родителска, т.е. консервативна, а другата синтезирана наново.

Репликация на едноверижна ДНК във вируси. Ако геномът е представен от едноверижна ДНК (както при някои вируси), тогава тази единична верига служи като шаблон за образуването на комплементарна верига, с която образува дуплекс, а след това или дъщерни дуплекси, или едноверижни копия на една от техните шаблонни нишки се синтезира на този дуплекс. Репликацията на генетичния материал на вируса обикновено се извършва с участието на ензими на клетката гостоприемник. Върху някои молекули на вирусна ДНК, нейните ДНК копия също се синтезират – с помощта на клетъчна или кодирана от вирус ДНК полимераза. Тези ДНК копия се използват по-късно при сглобяването на вирусни частици. Репликацията на ДНК на вирусите се случва или в ядрото на клетката гостоприемник (херпесен вирус), или в цитоплазмата (поксвируси).

Репликация в прокариоти. ДНК репликация(процесът, чрез който информацията, кодирана в базовата последователност на родителската ДНК молекула, се предава с максимална точност към дъщерната ДНК) се осъществява от специален ензим ДНК полимераза. Засаждането на този ензим върху една от нишките на ДНК се предшества от строго локализирано прекъсване на пръстена, ако ДНК е кръгла (в бактерии) и известно разплитане на крайната част на нейната гигантска двуверижна спирала. Забележете веднага, че ДНК полимеразата може да попадне на всеки от двата края на спиралата, но винаги върху веригата, за която този край е 3 "края (било то "кодираща" или "защитна" верига). Насърчаване на ензима по протежение на "матрицата" на майчината нишка винаги върви в посока от 3 "-края към 5-ия" край. Оттук следва, че новата ДНК верига, синтезирана според този шаблон, "комплементарна" към нея, ще започне със своите 5 "-край и расте в посока на своето бъдеще 3" - Тези две посоки не трябва да се смесват. нуклеотиди,който вече носи фосфатна група, свързана с 5"-въглерод на дезоксирибозата. Следователно, към предишния нуклеотид, който вече е на място, той трябва да бъде прикрепен към неговата OH-група, свързана с 3"-въглерод на дезоксирибоза. А това означава, че натрупването нова темаДНК върви в посока 5 "-3" ... Тук е уместно да припомним, че работата по насърчаване на ДНК полимеразата се извършва за сметка на енергията на прекъсването химическа връзкамежду първия и втория фосфати на съответния нуклеозид трифосфат - предшественикът на нуклеотида, който трябва да бъде прикрепен.

Сега да преминем към допълнения и уточнения. Нека започнем с факта, че в клетката на E. coli са открити не една, а три ДНК полимерази. Те се различават значително един от друг по молекулно тегло и по броя на молекулите на всяка от тях, съдържащи се в клетката. А също и от тяхната роля в процеса на репликация на ДНК.

Исторически, първият, който е открит и почистен ДНК полимераза I(Ензим Корнберг). После дойде ДНК полимерази II и III,Молекулните тегла на тези три ензима са съответно 109, 90 и 300 kDa, а представянето им в една клетка е 300, 40 и 20 броя. Разликата във функциите ще се види от това, което следва.

Започваме описанието на 1-ви етап на репликация с факта, че първоначалното развиване на края на двуверижната майка ДНК молекула се извършва с помощта на специален протеин "Топоизомераза".(прозрачност 6) в началото на репликацията - ori (origin - началото на репликацията).

Структура на началната точка на репликацията.ДНК фрагменти, носещи произхода на репликацията, са изолирани от E. coli и някои плазмиди, както и от дрожди и редица еукариотни вируси. В някои случаи произходът на репликацията има такава нуклеотидна последователност, че дуплексът придобива необичайна конфигурация, а вторият се разпознава от протеините, участващи в инициирането. Природата на взаимодействието между произхода на репликацията и протеините и механизмът на иницииране като цяло са малко проучени.

И така, топоизомеразата се движи по дължината на двуверижна молекула, отслабвайки водородните й връзки толкова много, че тези връзки се разрушават при температура от 37 ° C в късата крайна част, която е преминала. След топоизомераза, друг протеин седи върху майчината ДНК и започва да се движи по нея ДНК хеликаза,което ще изиграе своята роля по-късно. Тогава се обади специална РНК полимераза, работеща само от края на ДНК веригата "Примаза"изгражда много къса верига от рибонуклеотиди (нареч "Буквар")комплементарно към началото на ДНК веригата. При бактериите той е само 5 нуклеотида, докато при еукариотите е около 40. (На фиг. 28 всички праймери са показани с тънка линия, а всички ДНК вериги са показани с удебелени линии.)

Едва сега, непосредствено след праймера, ДНК полимеразата седи върху същата ДНК верига (нека се съгласим, за простота, за простота), която може да започне да изгражда комплементарна ДНК верига само започвайки от праймера, присъединявайки се към него („танцувайки от печката“ ) ... Това е ДНК полимераза III, най-голямата, състояща се от 6 субединици и основна функция в нейната функция - тя ще води "допълнителния синтез" на ДНК по тази първа верига на майчината ДНК до самия край. Първоначалното движение на тази ДНК полимераза е ограничено до 1-2 хиляди нуклеотида от първата верига (при еукариотите само 200 нуклеотида).

Втората основна нишка (все още празна) образува "вилица за редупликация" заедно с първата нишка.

Между хеликаза и ДНК полимераза III се образува определен участък от откритата първа верига. Втората тема също не е покрита с нищо. След като напуснат хеликазата, тези две нишки могат да се затворят отново. За да не се случи това, четири т.нар "ДНК-свързващ протеин".Не им се приписва никакви функции, освен защита срещу възстановяване на двойната спирала на ДНК в горната част на вилицата ...

След преминаване към горната част на вилицата на разклонените вериги на майчината ДНК, тандемните хеликаза-ДНК-свързващи протеини, ДНК полимераза III, спира (виж Фиг. 28). Топоизомераза върви по-нататък по двуверижната майчина ДНК, а хеликазата разрушава захарно-фосфатната връзка на 2-ра верига. Кондензиран в зоната, съседна на вилицата, завоите на двойната спирала се изправят, 1-ва ДНК верига, заедно с протеините, стоящи върху нея, се върти около оста си, а отрязано парче от 2-ра верига, временно свързано с хеликаза, също се върти около тази тема. Това парче се нарича "фрагментът на Оказаки" - на името на учения, открил появата на такива фрагменти по време на репликация. След като стресът се освободи, нишките на двойната спирала на ДНК на майката могат да започнат да се разделят отново. Но преди това, от изрязания край на фрагмента на Оказаки, друга примаза започва изграждането на нов рибонуклеотиден праймер върху него. След това хеликаза освобождава фрагмента и се движи напред, и специален ензим "лигаза"пришива началото на фрагмента на Оказаки на първоначалното му място - до 2-ра верига на ДНК на майката. Имайте предвид, че лигазата (M = 96 хиляди) в клетката на E. coli е представена от най-многобройната популация - около 200 молекули. От което следва, че не извършва произволна "ремонтна" работа, а е пълноправен член на набора от ензими, които осигуряват репликация на ДНК (подобно на значението на нишките за хирург).

Когато праймерът е готов, пред него, към 5 "края на 2-ра майчина ДНК верига, ДНК полимераза I сяда. Изграждането на верига, комплементарна на този фрагмент от 2-ра верига, започва отново в 3" - 5 „посока, броейки по протежение на ДНК полимераза I достига края на фрагмента на Оказаки и се отстранява, като по този начин завършва 1-вия етап на редупликация (фиг. 28).

Междувременно праймерът, останал в началото на 1-ва верига, се унищожава от определена "рибонуклеаза Н" - ензим, който разрушава РНК веригата в комплекс с веригата на ДНК. На негово място ДНК полимераза II поставя "правилните" дезоксирибонуклеотиди. В същото време топоизомераза, хеликаза и след това ДНК полимераза III се движат напред.

Започва вторият етап на репликация. Репликационната вилка също напредва, съседната част от майчината двуверижна ДНК става по-плътна и целият синтезиращ тандем спира. Helikaza отново отрязва 2-ра нишка, образувайки втория фрагмент на Okazaki. Както преди, в (временно) отрязания край на фрагмента се създава праймер, ДНК полимераза I се „прикрепя” към него и започва да копира втория фрагмент на Оказаки, т.е. 2-ра верига на майчината ДНК. Разликата във втория етап ще бъде само във факта, че по пътя на тази полимераза ще има праймер, останал от копирането на 1-вия фрагмент на Оказаки. Но ДНК полимераза I, за разлика от всички други ДНК полимерази, също има 5 "-3" екзонуклеазна активност, тоест по посока на движението си. Тя унищожава буквата и достига мястото, откъдето нейният предшественик е започнал да копира 1-ви фрагмент от Оказаки. Остава само да се свържат тези две части от новосинтезираната комплементарна нишка с фосфодиестерна връзка. Естествено, това се извършва от вездесъщата ДНК лигаза.

Подробното разглеждане на молекулярните механизми на регулиране на репликацията на ДНК е извън обхвата на книгата, така че ще се ограничим до няколко забележки относно този въпроси ще обсъдим по-подробно само механизма на регулиране на репликацията в E. coli, включително бактериални плазмиди, което е пряко свързано с функционирането на плазмидни вектори в бактериалните клетки.

Типични примери за увеличаване на броя на гените поради тяхната селективна репликация са увеличение rRNA гени и промени в броя на гените, които определят резистентността на клетките към лекарства. В първия случай загубата на някои от rRNA гените в Drosophila в резултат на делеция е придружена от постепенно възстановяване на техния брой, докато във втория случай в клетките под селективното действие на токсичен лекарствен продукт, броят на генните копия, необходими за неутрализирането му, се увеличава. По-специално, това е характерно за гена на дихидрофолат редуктазата в присъствието на метотрексат. Предполага се, че промяната в броя на копията на такива гени се основава на механизма на неравномерно кръстосване.

4.2.1 Иницииране и регулиране на репликацията на ДНК в E. coli

Репликацията на хромозомната ДНК в бактериите играе ключова роля в тяхната кръговат на живота... В хода на този процес микроорганизмите репликират своя геном и образуваните дъщерни геноми след това се прехвърлят в дъщерните клетки. Високата прецизност, с която бактериите извършват подобни процеси, показва наличието на специални механизми за тяхната координация и контрол.

^ Структура на началната област на репликация oriC. Хромозомата на E. coli съдържа единична начална област на репликация(произход) наименувано oriCна която се инициира репликация (фиг. I.47, а). Размерът на минималния регион на произхода на репликацията, който осигурява автономна репликация на хромозома, е 258 bp. (позиция 11-268 на фигура I.47). Сравнението на първичните структури на произхода на репликацията на различни ентеробактерии показва, че техните последователности са представени от къси запазени участъци, които са осеяни с отклонени ДНК сегменти, чиито дължини обаче са силно запазени. Оказа се, че запазените региони са места на свързване за регулаторни протеини, разделени от спейсерни последователности. OriCсъдържа пет консенсусни 9-нуклеотидни инициаторни свързващи места DnaA (непалиндромни повторения), наречени DnaA-кутии. При всички Enterobacteriaceae регионите на произход на репликацията съдържат 9–14 GATC места, осем от които са запазени.

Отляво oriCима богата на АТ област, съдържаща три подобни последователности, дълги 13 нуклеотида, всяка от които започва с GATC. Тук се намира и AT клъстерът, който заедно с лявата 13-нуклеотидна последователност образува област на нестабилна ДНК спирала ( Елемент за отвиване на ДНК). Този участък от ДНК може да бъде заменен без загуба на функция за подобен нуклеотиден състав, но с различна нуклеотидна последователност.

OriCсъдържа свързващи места за протеини, които огъват ДНК, IHF (интеграционен фактор гостоприемник) и FIS (фактор за инверсионна стимулация). И двата протеина изглежда помагат на инициатора на DnaA да развие ДНК.

Димерният IciA протеин, състоящ се от 33 kDa субединици, специфично се свързва с AT-богатите 13-mer повторения. Функцията на този протеин е неизвестна, както и функцията на Rob протеина, който специфично взаимодейства с 26-нуклеотидния сайт от дясната страна на кутията R4 DnaA. ДНК близо до мястото на Роб показва огъване, което е по-изразено в молекули, напълно метилирани от Dam метилтрансфераза (виж по-долу). Тези напълно метилирани ДНК взаимодействат с хистоноподобния протеин H-NS, чието място на свързване се припокрива с Rob мястото. Това взаимодействие оказва влияние върху функционирането oriC.

Ориз. I.47. Структурата на областта на произход на репликацията на хромозомата на E. coli ( а) и схемата за иницииране на нейната репликация ( б)

HobH е протеин, който взаимодейства с едноверижно свързване с метилиран произход на ДНК
^ Функции на ДНК протеин. DnaA протеинът играе ключова роля в сглобяването репликоми- многокомпонентен протеинов комплекс, осъществяващ двупосочен синтез на ДНК. Протеинът разпознава произхода на репликацията и привлича останалите протеинови компоненти на репликите към мястото на сглобяване.

^ Етапи на иницииране на синтеза на ДНК на oriC. Сглобяване оригинала комплексзапочва с взаимодействието на DnaA протеина с DnaA кутиите R1 – R4 и M (виж фиг. I.47, б). За успешно преминаване на следващите етапи на сглобяване на реплицизома, протеинът DnaA трябва да бъде комплексиран с АТФ и да взаимодейства със свръхнавита oriC. С помощта на електронен микроскоп първоначалният комплекс се открива като компактна елипсоидална структура, съдържаща 20 DnaA мономера, която покрива oriC. Първоначалният комплекс има силно подредена структура.

В присъствието на АТФ във висока концентрация (5 mM), първоначалният комплекс се превръща в открит комплекс... В този комплекс има частично развиване на богати на АТ 13-нуклеотидни повторения, разположени от лявата страна oriC... При 37 ° C или по-висока, един протеин DnaA може да осигури разплитане на ДНК. Образуването на отворен комплекс при по-ниски температури изисква участието на структуриращия протеин HU или интегриращия фактор на бактерията гостоприемник IHF. В отворения комплекс от дясната страна се намират малки участъци от нетъкана ДНК oriCмежду DnaA кутии R2 и R4, които се считат за места за кацане на хеликаза.

Протеинът DnaB е репликативна хеликаза с вилка и влиза в отворен комплекс, за да се образува предварителен комплекс Iчрез взаимодействие с едноверижни области на частично развита ДНК. Тези места се приготвят от протеина DnaA, който измества SSB протеина от съответните места. DnaB е включен в предварителния комплекс I под формата на хексамери, които са образували комплекс с шест DnaC мономера, всеки от които свързва една АТФ молекула. В този комплекс хеликазната активност на протеина DnaB е блокирана. Освобождаването на DnaC от комплекса става в резултат на хидролиза на АТФ. Последица от това е активирането на DnaB хеликазата и правилното й местоположение в комплекса. Комбинацията от тези събития трансформира предварителния комплекс I в предварителен комплекс II.

Helicase трябва да започне да функционира в началото на репликационната вилка от дясната страна oriCблизо до DnaA кутии R2, R3 и R4. За целта той трябва да бъде преместен от мястото на първоначалното му влизане в комплекса до точката на произход на репликацията. Предполага се, че транслокацията е свързана с АТФ-зависимо освобождаване на DnaC протеина от комплекса, което е придружено от активиране на хеликаза.

V грундиращ комплекс Helicase DnaB взаимодейства с DnaG-примазата, която играе ключова роля за осигуряване на иницииране на репликация точно върху oriC... И двата ензима осигуряват конюгиране на функционирането на две репликативни вилки, движещи се в противоположни посоки. В безклетъчна система, при ниски концентрации на примази, репликацията става еднопосочна и може да бъде инициирана не на oriC... В първичния комплекс присъствието на DnaA протеина вече не е необходимо и след освобождаване от комплекса, той може да бъде използван повторно за иницииране на репликация на друг oriC... Смята се, че по време на координираното сглобяване на две репликационни вилки, в една от тях се синтезира праймер, който става праймер, когато водещата нишка се синтезира от другата репликативна вилка, движеща се в обратна посока. Примазата в грундиращия комплекс функционира според разпределителния механизъм. След синтеза на праймерите, той напуска репликационната вилица и се заменя с нова молекула на примаза по време на образуването на следващия фрагмент на Okazaki.

По време на образуването на реплицизома във всяка репликативна вилка, възниква АТФ-зависимо образуване на димерен комплекс на холоензимната ДНК полимераза III, свързан към 3' края на праймерите (плъзгаща се скоба, виж по-горе). ДНК вериги. безклетъчна система, отправните точки на синтеза на водещите вериги са oriC близо до DnaA кутии R2, R3 и R4.

^ Механизми за контрол на инициирането на репликация in vivo. Инициирането на репликация на ДНК в E. coli се регулира най-малко на три нива: 1) инициирането е синхронизирано с клетъчния цикъл; 2) Синтезът на ДНК във всеки регион на произхода на репликацията в клетъчния цикъл се инициира само веднъж; 3) инициирането се случва синхронно във всички области на началото на репликацията, присъстващи в това бактериална клетка... Установено е, че синтезът на ДНК започва след като масата на бактериалната клетка на един регион от началото на репликацията достигне определена стойност, наречена масово иницииране(инициативна маса). Понастоящем протеинът DnaA се счита за основен пейсмейкър (пейсмейкър), който играе ключова роля в контрола на инициирането на репликация.

Потискането на протеиновия синтез in vivo е придружено от завършване на вече инициирания синтез на ДНК на фона на прекратяването на нови кръгове на иницииране. Възобновяването на протеиновия синтез води до иницииране на репликация след период на закъснение от едно клетъчно поколение. В присъствието на всички необходими протеини инициирането е чувствително към рифампин, специфичен инхибитор на бактериалната РНК полимераза, което показва зависимостта на инициирането от синтеза на нетранслирана РНК.

Роля на топологията oriC в инициирането на репликация . Топоизомераза I и топоизомераза II (ДНК гираза) поддържат бактериалната хромозома в отрицателно свръхнавито състояние. Около половината от суперспиралите се неутрализират от хистоноподобните протеини HU, IHF и FIS, докато останалата супернавивка на бактериалната хромозома улеснява транскрипцията, репликацията и специфичната за мястото рекомбинация. Предполага се, че бактериалната хромозома се състои от 40-50 супернавита домейна с 25 супернамотки на kb. ДНК. Понастоящем няма точни данни за топологичното състояние oriCнеобходими за инициирането на репликация в E. coli. Известно е, че мутации в гена на топоизомераза topAпотискат температурно-чувствителните мутации dnaA(Тс)... Предполага се, че в тези мутантни щамове топологията oriCмодифициран по такъв начин, че позволява иницииране на репликация при по-ниски вътреклетъчни концентрации на протеина DnaA. В допълнение, важността на определено топологично състояние oriCза иницииране показва факта на нарушение на инициирането в мутантни бактерии с променен ген gyrB(Тс)кодираща В-субединицата на ДНК гиразата.

Активиране на репликация чрез транскрипция. В случай, че свръхнавиването на минихромозоми или съдържащи плазмиди oriC, е недостатъчна за иницииране на тяхната репликация, инициирането може да се случи с едновременна транскрипция на ДНК в близост oriC... Промяна на топологията oriCв този случай може да се извърши поради образуването R-примки(ДНК – РНК хибрид в двуверижна ДНК) или в резултат на транскрипция, като такава, при която преди транскрибиращата РНК полимераза има локално положително супернавиване на ДНК, а след него – отрицателно. Това улеснява образуването на отворени комплекси при иницииране на синтеза на ДНК.

^ Ролята на протеинаДНКАв регулирането на инициирането на репликация.~ 60 минути са необходими на бактериите, за да репликират хромозомната ДНК, да отделят дъщерните хромозоми и да се подготвят за ново делене. Следователно клетките с време за генериране, по-кратко от този период (например, при повишени температури върху богата хранителна среда) трябва да инициират репликацията на хромозомите, предназначени за последващи деления преди завършването на предишния кръг на репликация. По този начин една клетка може да съдържа репликираща се хромозома с множество произходи на репликация. В този случай инициирането на репликация в множество начални обхвати на репликация става едновременно.

Свръхпродукцията на DnaA в бактериите води до рязко увеличаване на честотата на иницииране на репликация без промяна на общата скорост на синтеза на ДНК, което показва DnaA като положителен регулатор на този процес. Сред моделите, обясняващи механизма на регулаторното действие на протеина DnaA, моделът за титруване на DnaA е най-широко използваният. В съответствие с този модел, целият новосинтезиран протеин DnaA се свързва (титрира) от DnaA кутии oriCхромозоми. Веднага щом броят на инициаторните молекули надвиши броя на вътреклетъчните DnaA кутии (всички DnaA кутии са заети от протеина), започва синтеза на ДНК. След започване на инициирането на един oriCима освобождаване на молекули DnaA, рязко повишаване на нейната вътреклетъчна концентрация и синхронно иницииране на синтеза на ДНК в други достъпни области от началото на репликацията. В същото време асоциацията с мембраните на първия oriCго предпазва от използване при повторно иницииране.

Ролята на метилирането на Dam в инициирането на синтеза на ДНК. Както бе споменато по-горе, E. coli Dam метилтрансфераза модифицира адениновите остатъци в 5'-GATC последователностите. В резултат на репликацията, молекулата на ДНК временно се трансформира от напълно метилирана молекула в метилирана по една верига, което позволява на клетката да разпознават новосинтезирана ДНК Местоположение на клъстери Дам- сайтове в oriC enterobacteriaceae са силно запазени (виж фиг. I.47, а). Неметилирана или полуметилирана плазмидна ДНК в мутантни клетки на дам не се реплицира, въпреки че служи като субстрат в безклетъчна репликационна система. Репликацията на хромозомната ДНК при мутанти на язовирите започва при oriC, обаче контролът на репликацията е нарушен, което се проявява в асинхронната репликация на множество oriC. Оказа се, че само наполовина метилирани, но не напълно метилирани или неметилирани oriC-ДНК специфично се свързва с мембранната фракция на E. coli in vitro. Освен това в бързо растящите клетки 1/3 от времето на генериране oriC-ДНК е в полуметилирано състояние, след което е напълно метилирано. Същото е характерно и за промотора на генния инициатор на DnaA, при който полуметилираното състояние е свързано с потискане на генната транскрипция. Обратно, реметилирането на новосинтезираната ДНК верига на останалата част от бактериалната хромозома се случва бързо - в рамките на 1-2 минути. Въз основа на този вид данни се предполага, че в непълно метилирано състояние, гореспоменатите последователности се скринират от бактериални мембрани от контакти с регулаторни протеини и не могат да участват в повтарящия се кръг на иницииране на репликация (период затъмнение). Генни мутации seqAрязко намалява времето на затъмнение, което се проявява в асинхронността на инициирането на репликация. Протеинът SeqA се оказа отрицателен регулатор на инициирането на репликация, действащ на етапа на взаимодействие oriCс бактериални мембрани.

^ Ролята на протеина SeqA в регулирането на репликацията на бактериалната хромозома. ген seqA кодира протеин с дължина от 181 аминокиселинни остатъка, чието инактивиране е смъртоносно за бактериалните клетки. Изследването на взаимодействието на този протеин с неметилирани, частично и напълно метилирани участъци от произхода на репликацията чрез метод за изместване на лентата по време на електрофореза в полиакриламиден гел показа неговото преференциално свързване към частично метилирани последователности. За пълната (контекстно-зависима) специфика на взаимодействието му обаче е необходимо наличието на допълнителни фактори. Всъщност в състава на ДНК-протеинови комплекси, образувани с участието на частично метилирани последователности oriCе открит протеин с молекулно тегло 24 kDa, който специфично взаимодейства с метилираната ДНК верига в oriC... Скринингът на клонирана библиотека от последователности на Е. coli позволява клониране на ген hobH (хемиметилиран произход свързване), кодиращ този протеин. Мутациите в този ген доведоха до частична загуба на синхронизация от бактериални клетки в инициирането на репликация, което също индиректно показва участието на HobH протеина в регулирането на инициирането на репликация на бактериалните хромозоми в ранните етапи на клетъчния цикъл. Въпреки това, истинската роля на този протеин в репликацията не е напълно разбрана.

Периодът на затъмнение може да приключи в резултат на постепенното завършване на метилирането на частично метилирана последователност oriCкомплекс с мембрани. Пълното метилиране на тези последователности предотвратява тяхното взаимодействие с мембраните и ги прави достъпни за DnaA инициатора.

^ Прекратяване на репликацията. Срещата на две репликационни вилици в края на цикъла на репликация на бактериална хромозома е придружена от няколко събития, които са необходими за пълното разделяне на две образувани бактериални хромозоми преди клетъчното делене. Движението на репликативните вилици една към друга се придружава от хомоложна рекомбинация между дъщерните хроматиди. В случай, че броят на настъпилите рекомбинации е нечетен, се образува димер на бактериалната хромозома, докато при четен брой рекомбинации се образуват две катенирани (свързани една с друга) хромозоми. Във втория случай, разделянето на катенаните от топоизомераза IV води до пълно разделяне на дъщерните хромозоми, докато в случай на бактериален хромозомен димер това не е достатъчно. Разделянето на димера с образуването на мономери възниква в резултат на специфична за мястото рекомбинация в локуса разнпод действието на резолваза (сайт-специфична рекомбиназа) XerCD.
^

4.2.2 Регулиране на ColE1 плазмидна репликация

Много прокариотни клетки съдържат, в допълнение към основната хромозома, малка екстрахромозомна ДНК, наречена плазмиди... Плазмидите, чиито размери варират от няколко хиляди до стотици хиляди базови двойки и броят на копията на клетка - от една до няколкостотин, са способни на автономна (независима от основната хромозома) репликация и се наследяват стабилно в продължение на брой клетъчни поколения. Въпреки че много плазмиди дават значителни селективни предимства на клетките гостоприемници (резистентност към антибиотици, тежки метали и др.), повечето от тях са загадъчно, т.е. не се проявява във видимия фенотип на клетките. Тъй като съществуването им е значителна тежест за метаболизма на клетките гостоприемници, смисълът на тяхната еволюционна стабилност остава неясен. Въпреки факта, че в природни условияБактериалните клетки очевидно не изпитват селекционен натиск, насочен към запазване на плазмиди вътре в клетките; последните, използвайки фини механизми, които регулират броя на техните копия в клетките, стабилно сегрегират между дъщерните бактериални клетки.

Произходът на репликация на малък плазмид ColE1, носещ гени за резистентност към колицин, традиционно се използва в генното инженерство за конструиране на векторни ДНК молекули, които се използват за клониране и експресиране на къси нуклеотидни последователности в клетките на E. coli. Ето защо е препоръчително да се разгледат механизмите за контрол на репликацията на плазмида ColE1.

^ Иницииране на репликация на плазмида ColE1. Репликацията на плазмида ColE1 се извършва в една посока (еднопосочна репликация) с помощта на репликативния апарат на клетката гостоприемник. Сам по себе си плазмидът не кодира нито един ензим, който би бил необходим за неговата репликация. Районът на произход на репликацията съдържа два промотора, единият от които осигурява синтеза на РНК праймера (РНК II), който е необходим за инициирането на плазмидна репликация. Синтезираната РНК II, чиято дължина зависи от вида на реплицирания плазмид, се обработва допълнително от РНКаза Н за образуване на РНК с дължина 550 нуклеотиди. Тази молекула се използва ефективно от ДНК полимераза I като праймер в синтеза на водещата ДНК верига. В отсъствието на РНКаза Н, 3'-краят на РНК II служи като праймер по време на репликация, макар и с по-ниска ефективност. В клетки, дефектни в РНКаза Н и ДНК полимераза, репликацията на ColE1 се инициира от ДНК полимераза III с участието на РНК II съгласно механизма, описан подробно по-горе.

И трите механизма на иницииране на плазмидна репликация се основават на уникалното свойство на РНК II да образува стабилен ДНК-РНК хибрид в областта на произхода на репликацията. Всъщност нормалните транскрипти се освобождават от транскрипционния комплекс след завършване на транскрипцията и отделяне на РНК полимеразата от матрицата, което не е случаят с РНК II. Анализът на дефектни в репликацията плазмидни мутанти, както и на техните ревертанти, показа, че в стабилен хибрид на РНК II с матрица възниква взаимодействие между G-богатата РНК II бримка, образувана 265 нуклеотида над точката на иницииране на репликация (позиция -265 ) и ДНК богатата на C област, разположена в близост до нуклеотид -20 (фиг. I.48, а). Установено е, че и двете от тези последователности са запазени в свързаните плазмиди pMB1, p15A и KSF1030. Взаимодействията между посочените последователности, очевидно, възникват в момента, когато РНК полимеразата все още е в транскрипционния комплекс и ДНК нишките в близост до комплекса са развити. Балансът между двете алтернативни конформации на РНК II е от решаващо значение за определяне на дела на РНК молекулите, оставащи в хибрида ДНК-РНК, необходими за иницииране на плазмидна репликация. Изборът между двете алтернативни конформации на РНК II се определя от първичната структура на областта, разположена между нуклеотиди –359 и –380 (последователност ) (виж Фигура I.48, б). Тази последователност може да взаимодейства с възходяща комплементарна последователност (структура ) или с хомоложна последователност , разположена отдолу (структура ). След като РНК полимеразата транскрибира първите 200 нуклеотида, получената РНК II образува временна вторична структура, която се характеризира с наличието на три домена на стволови бримки (I, II и III). Удължаването на РНК II с още няколко нуклеотида води до разрушаване на стъбло III и образуване на стъбло IV, което се стабилизира в резултат на комплементарни взаимодействия между последователностите и. По време на последващото удължаване на РНК II тя има две алтернативни възможности за формиране на вторичната си структура. Изборът в полза на една или друга конформация зависи от това дали последователността  остава свързана с последователността  или образува нови контакти с последователността. Преходът от комплементарни двойки  към  е придружен от силни промени в конформацията на РНК II, които в крайна сметка определят способността й да служи като праймер по време на плазмидна репликация. Молекулите РНК II в  конформацията могат да образуват РНК-ДНК хибрид, служещ като субстрат за РНКаза H, но в  конформация не го правят. Предложеният модел се потвърждава преди всичко от факта, че мутациите, които правят за предпочитане образуването на  конформацията поради дестабилизиране на IV стъбло, възпрепятстват функционирането на РНК II като праймер и водят до намаляване на броя на копията на плазмида ColE1 вътре в бактериалните клетки. Такива дефектни по репликация мутантни плазмиди се активират от супресорни мутации, които стабилизират IV стъбло. По този начин инициирането на репликация на плазмида ColE1 зависи от способността на РНК II да образува РНК-ДНК хибрид близо до началото на репликацията (ori). В този случай образуването на хибрид се влияе от вторичните и третичните структури на горната нуклеотидна последователност на предшественика на праймера.

^ Ориз. I.48. Регулиране на репликацията на плазмида ColE1

а- предполагаема вторична структура на РНК II, след транскрипция от РНК полимераза  500 нуклеотида от плазмидна ДНК; по-нататъшното удължаване на РНК II е придружено от образуването на ДНК-РНК хибрид (удебелена стрелка) между РНК II и транскрибираната ДНК;

б- възможен механизъм за контролиране на репликацията на плазмида. Горната част на фигурата показва генетичната карта на ДНК региона, необходима за инициирането и контрола на репликацията на плазмидна ДНК. Пространствените структури на два инхибитора на плазмидна репликация: РНК I и протеин Rop са показани схематично. Долната част показва две алтернативни конформации на РНК II, образувани под действието на РНК I, I – X - елементи от вторичната структура
^ Контрол на броя на копията на плазмида ColE1. Контролът на инициирането на репликация на плазмида ColE1 се осъществява главно на нивото на промените в пространствената структура на РНК II. Тъй като плазмидите контролират собствената си биосинтеза, т.е. тяхната репликация протича по автокаталитичен механизъм; постулира се, че инициирането на ColE1 репликация е под влияние на инхибитор, кодиран от плазмид, чиято концентрация в клетката е толкова по-висока, колкото по-голям е броят на вътреклетъчните копия на плазмида . Всъщност анализът на механизмите на репликация на мутантни плазмиди, които се характеризират с голям брой копия, направи възможно идентифицирането на две транс-действащ фактор, кодиран от плазмида и влияещ върху репликацията на плазмида in vivo.

Основният инхибитор на репликацията е малка РНК с дължина 108 нуклеотида, наречена РНК I, напълно комплементарна на 5'-терминалната последователност на предшественика на праймера (РНК II). Генният промотор на РНК I се намира в областта на произхода на репликацията на плазмида ColE1 и е насочен в обратна посока на промотора на РНК II (виж Фиг. I.48). Допълнителните взаимодействия между РНК I и РНК II влияят върху образуването на пространствената структура на РНК II по такъв начин, че за предпочитане възниква βγ конформацията, която е неактивна по отношение на инициирането на репликация (виж Фиг. I.48, б, долу вдясно).

Взаимодействието между РНК I и РНК II се осъществява продуктивно само докато се синтезира кратък RNA II транскрипт с дължина не повече от 80 нуклеотида. Въпреки че взаимодействието на РНК I с такава къса нуклеотидна последователност протича по-бавно, отколкото с транскрипт от 360 нуклеотида на дължина, в последния случай РНК I не засяга конформацията на 5'-терминалната част на РНК II и нейната способност да функционира като праймер по време на плазмидна репликация (конформация αβ, фиг. I.48, б, долу вляво). От това става ясно, че скоростта на образуване на хибриди между РНК I и РНК II е решаваща за ефективното функциониране на механизма за регулиране на плазмидната репликация. Процесът на взаимодействие между РНК I и РНК II е проучен подробно. Той преминава през образуването на няколко междинни съединения и завършва със стабилен хибрид между напълно комплементарната РНК I и 5'-терминалната област на РНК II.

^ РНК организиращ протеин Rop. Генът за втория компонент, който регулира негативно репликацията на плазмида ColE1, е картографиран непосредствено зад началото на репликацията. Този ген кодира 63-bp протеин, наречен Rop (репресор на праймера), който съществува в разтвор като димер. Както in vivo, така и in vitro, Rop повишава инхибиторната активност на РНК I, без да засяга синтеза на РНК II. В същото време Роп въздейства начални фазивзаимодействия между РНК I и РНК II, улесняващи прехода на много нестабилен междинен продукт C * към по-стабилен - C m *. Протеинът Rop има висок афинитет към C* и слабо взаимодейства с изолирани РНК I и РНК II in vitro. Смята се, че Rop проявява малка специфичност за нуклеотидни последователности и разпознава някои общи характеристикиструктурата на комплекса РНК I – РНК II, възникващ в ранните етапи на тяхното взаимодействие. По този начин функциите на протеина Rop, очевидно, се състоят в трансформирането на нестабилния РНК-РНК комплекс в по-стабилен, което от своя страна се придружава от потискане на образуването на праймера, необходим за инициирането на репликация на плазмида ColE1.

Използването на антисенс РНК за контролиране на репликацията на бактериални плазмиди е обичайна практика. По-специално, репликацията на малкия R1 плазмид с ниско копие се контролира от протеина RepA, който участва в инициирането на плазмидна репликация като положителен регулаторен фактор. Синтезът на RepA от своя страна се регулира пост-транскрипционно от малката антисенс РНК CopA, която се свързва с RepA-mRNA в многоетапна реакция, подобна на сливането между РНК I и РНК II, обсъдено по-горе. Това взаимодействие потиска генната експресия репАвероятно поради разцепване на РНК-РНК дуплекс от РНКаза III. Вътреклетъчната концентрация на антисенс CopA-RNA е право пропорционална на броя на копията на плазмида R1. Подобен механизъм е описан за регулиране на инициирането на репликация на плазмида Staphylococcus aureus pT181.

При приготвянето на бактериални вектори за генно инженерство, много от които съдържат произхода на репликацията на плазмида ColE1, инхибитори на протеиновата биосинтеза, по-специално хлорамфеникол, често се използват за увеличаване на броя на копията им в бактериалните клетки. След обсъждане на механизмите за регулиране на контрола на репликацията на този плазмид стават ясни принципите, на които се основава тази техника. Действително, въвеждането на хлорамфеникол в хранителната среда блокира биосинтезата на бактериални протеини, включително протеина Rop, който е необходим за ефективно потискане на инициирането на плазмидна репликация под действието на РНК I. В резултат на това контролът на броя на копията на плазмидите в бактериалните клетки се разрушават и те започват непрекъснато да се възпроизвеждат, използвайки предварително синтезирани бактериални протеини за тази цел.

Известно е, че два фенотипно различни плазмида, използващи един и същ механизъм за контрол на репликацията, са несъвместими в една и съща бактериална клетка. Клетки, съдържащи два плазмида от различни групи за съвместимост, в процеса на възпроизвеждане бързо образуват две популации, всяка от които съдържа само един вид плазмид. Това се дължи на произволен подбор на плазмиди за репликация в бактериалните клетки и произволно разпределение на първоначалния пул от плазмиди между дъщерните клетки. Еволюционната поява на механизъм за контролиране на репликацията на бактериални плазмиди с помощта на антисенс РНК разшири възможностите за появата на плазмиди, принадлежащи към различни групи за съвместимост и съжителстващи в едни и същи бактериални клетки. Всъщност, въпреки използването на същия механизъм, антисенс РНК с различни нуклеотидни последователности няма да могат да разпознаят "чужди", хетероложни РНК мишени. Това позволява на такива плазмиди да съществуват съвместно в една бактериална клетка и създава условия за по-широкото им разпространение в естествените популации от микроорганизми.

Лекция 3. Репликация на различни ДНК и нейното регулиране и възстановяване

Репликация в прокариоти. ДНК репликация(процесът, чрез който информацията, кодирана в базовата последователност на родителската ДНК молекула, се предава с максимална точност към дъщерната ДНК) се осъществява от специален ензим ДНК полимераза. Засаждането на този ензим върху една от нишките на ДНК се предшества от строго локализирано прекъсване на пръстена, ако ДНК е кръгла (в бактерии) и известно разплитане на крайната част на нейната гигантска двуверижна спирала. Забележете веднага, че ДНК полимеразата може да попадне на всеки от двата края на спиралата, но винаги върху веригата, за която този край е 3 "края (било то "кодираща" или "защитна" верига). Насърчаване на ензима по протежение на "матрицата" на майчината нишка винаги върви в посока от 3 "-края към 5-ия" край. Оттук следва, че новата ДНК верига, синтезирана според този шаблон, "комплементарна" към нея, ще започне със своите 5 "-край и расте в посока на своето бъдеще 3" - Тези две посоки не трябва да се смесват. нуклеотиди,който вече носи фосфатна група, свързана с 5"-въглерод на дезоксирибозата. Следователно, към предишния нуклеотид, който вече е на място, той трябва да бъде прикрепен към неговата OH-група, свързана с 3"-въглерод на дезоксирибоза. А това означава, че натрупването на нова ДНК верига върви в посока 5 "-3" ... Тук е уместно да се припомни, че работата по насърчаване на ДНК полимеразата се извършва благодарение на енергията на разрушаване на химическата връзка между първия и втория фосфат на съответния нуклеозид трифосфат, предшественик на нуклеотида, който трябва да бъде прикрепен.

Втората основна нишка (все още празна) образува "вилица за редупликация" заедно с първата нишка.

рибонуклеаза H

ДНК полимераза II

Междувременно в областта на формиране на третия връх на репликационната вилка се случват точно същите събития като при 2-ри етап на редупликация. Скоростта на този процес се оценява на около 1000 нуклеотида в секунда при бактерии, 100 при животни и 20 при растения.

Много вероятно е в същото време подобни процеси на развиване на двойната спирала с образуването на фрагменти на Оказаки и комплементарното изграждане на нови ДНК вериги също да протичат от противоположния край на ДНК на майката. Разбира се, там ДНК полимераза III непрекъснато се движи по тази ДНК верига, която нарекохме 2-ра, а 1-вата верига се нарязва на фрагменти на Оказаки. Когато двете движения се срещнат, двете дъщерни копия на оригиналната ДНК са готови. (Те ще бъдат „зашити“ от една и съща лига.) Между другото, се оказа, че дължината на фрагментите на Okazaki в E. coli (1-2 хиляди нуклеотида) е много по-дълга, отколкото при еукариотите (по-малко от 200). Интересно е съвпадението на тази последна цифра с дължината на ДНК в нуклеозомата (виж по-долу).

По-сложен модел на движението на репликативната вилица включва образуването на реплицизома, мултиензимен комплекс с по-високо ниво на организация. Този комплекс се състои от функционален комплекс примозома-примаза, хеликаза, полимераза III и евентуално гираза. Такъв комплекс може да осигури удължаване на водещата верига и в същото време иницииране на праймерна РНК, както и завършване на ДНК по време на синтеза на изоставащата верига. Две репликозоми, работещи съвместно в две репликационни вилици, които се движат в противоположни посоки по кръглата хромозома, биха направили този модел още по-елегантен.

Репликация на пръстеновидни дуплекси. Репликацията също се инициира в началото на репликацията (ori).

Нарастващите вериги образуват репликативни вилици, които се пресичат или в две (отгоре) или в една (отдолу) посоки, в зависимост от естеството на произхода на репликацията.

В някои кръгови геноми всяка верига има свой собствен произход на репликация (например в митохондриалната ДНК на животните). Синтезът на една верига започва в точката ori>R>. Когато нова верига достигне точката ori> D>, започва синтеза на друга верига. Синтезът се инициира от образуването на праймерна РНК.

Някои двуверижни пръстенни хромозоми се репликират по алтернативен начин, наречен репликация като търкалящ се пръстен.В този случай двуверижната кръгова ДНК се разрязва със специфичен ензим на уникално място на една верига (точката на началото на подвижния пръстен) и нуклеотидите се прикрепват към образувания в резултат на това 3΄-хидроксилния пръстен на разреза от полимераза III; в този случай за матрица служи непокътната затворена верига. Така във вилицата се синтезира само водещата нишка. Докато синтезиращата верига продължава, 5΄-краят на врязания пръстен се измества като единична верига. В резултат дължината на водещата верига може да надвиши дължината на матрицата с 2-5 пъти. Този метод на репликация се използва от фагите M13 или fX174 (техните зрели геноми са едноверижна кръгова ДНК) в късните етапи на инфекциозния процес, след като инфектиращата ДНК се превърне в двуверижна кръгова форма. Непрекъснато отделящи се единични нишки на ДНК, образувани по време на репликация на подвижния пръстен, се врязват при всеки източник на репликация и се затварят, за да образуват зрели форми, които са опаковани във вирусни частици. Фаг λ използва този метод на репликация, за да образува двуверижна линейна вирусна ДНК. В този случай матрицата на субстрата е двуверижна кръгова ДНК, която се репликира след трансформацията на линейна вирусна ДНК в кръгова репликативна форма в ранните етапи на инфекцията.

Що се отнася до механизма на редупликация при еукариотите, въпреки че е по-малко разбран, тук са открити и характеризирани до пет ДНК полимерази, които обикновено се означават с гръцки букви: α, β, γ, δ и ε. Основният ензим, подобен на ДНК полимераза III в бактериите, е ДНК полимераза δ. ДНК полимераза α е отговорна за изграждането на праймери (от рибонуклеотиди). ДНК полимераза β - копира фрагменти от Оказаки и е отговорна за възстановяването на ДНК. ДНК полимераза γ води синтеза на ДНК в митохондриите. Функцията на ДНК полимераза ε все още е неизвестна.

Разбира се, гигантската ДНК на висшите организми започва да се възпроизвежда не само от краищата на молекулата, но и в много междинни точки. Смята се, че дрождите имат около 300 такива точки на произход на репликация.Те са разположени на 40 хиляди базови двойки една от друга. В човешката ДНК има до 20 000 изходни точки, разположени на интервали от 150 хиляди базови двойки. Очевидно поредици от относително слаби свързани ATбазови двойки. Веднъж инициирана, репликацията продължава в две посоки от всяка точка, докато разклоненията на две съседни начални точки на репликация се слеят. ДНК с пълна дължина на всяка дъщерна хромозома се получава чрез свързване на по-къси независимо инициирани новосинтезирани вериги.

Теломери и центромери. Центомерите и теломерите са най-изразените морфологични структури на хромозомите (прозрачност 12). Дълго време се смяташе, че тяхната структура и функции са свързани с някои специални ДНК последователности. Въпреки това беше възможно да се идентифицира само една такава характеристика на молекулярно ниво: наличието на центромери и теломери в региона сателитна ДНК... Сателитната ДНК се състои от дълги тандемни повторения, разположени в областта на центромерите и теломерите.

Структура на центромера... При бозайниците центромерите имат сложна дископодобна структура, наречена кинетохор. От всяка страна на хромозомата има по един кинетохорен диск. По време на митоза микротубулите на фибрилите на вретеното се прикрепят директно към плътния външен слой на кинетохора, свързан с хроматиновите бримки. Кинетохорът в дрождите образува CEN региони (къси ДНК сегменти) заедно с ДНК-свързващи протеини (прозрачност 13). Последователностите, разположени от едната или от двете страни на CEN регионите, могат да блокират преминаването на репликационната вилица, докато се появи специфичен сигнал, позволяващ края на репликацията в анафаза, в който случай броят на хромозомите няма да надвишава една на дъщерна клетка.

Теломерни последователности.Теломерите, краищата на еукариотната хромозома, също са краищата на линеен ДНК дуплекс. Именно с теломерите се свързва един от проблемите на репликацията: как се завършват 5΄-краищата на хромозомния дуплекс, ако ДНК полимеразите не инициират синтеза на нови вериги? Може би този проблем се решава по същия начин, както при репликацията на линейния дуплекс на аденовирусите, или чрез използване на алтернативни механизми? Последните данни показват, че крайните области на еукариотните хромозоми - теломерите - се репликират по специален механизъм. Краищата на хромозомите на дрождите, безгръбначните, растенията и гръбначните имат подобна структура: те съдържат фиби структури, в които 3 'и 5' края на ДНК дуплекса са съседни и има много тандемни повторения. Има множество едноверижни прекъсвания близо до цикъла в една от нишките в областта на повторенията. Наскоро от Тетрахименабеше изолиран ензим - теломераза - терминална дезоксинуклеотидилтрансфераза, която прикрепя 5'-TTGGGG-3 'повторение, последователно един нуклеотид в даден момент, към 3' края на специфични олигонуклеотидни праймери (TTGGGG)> n> ( Тетрахимена) и (TGTGTGGG)> n> (дрожди). По този начин теломеразата може да изгради теломери, докато родителската ДНК не се използва като шаблон (прозрачност 20). Теломеразата е голям рибонуклеопротеинов комплекс и за проявата на ензимна активност са необходими както РНК, така и протеини. На фигурата е показана хипотетична схема на образуване на теломери. Горната част на фигурата показва образуването на бримка в края на веригата, съдържаща последователността 5΄- (TTGGGG)> n> -3΄, и едноверижни прекъсвания на противоположната верига, съдържаща последователността 5΄- ( CCCCAA)> n> -3΄. Към 3 'края на долната верига с помощта на телезомераза, 5' - TTGGGG -3' единици са прикрепени последователно, един нуклеотид в даден момент. Примазата и ДНК полимеразата копират 5΄- (TTGGGG)> n> -3΄-верига с образуването на нови 5΄- (CCCCAA)> n> -3΄-единици. В резултат на непълно лигиране, едноверижните прекъсвания остават във веригата, богата на С. В 3 'края на 5' (TTGGGG)> n> -3 'верига отново се образува бримка, стабилизирана от взаимодействията между гуанозиновите остатъци.

Прекратяване на репликацията.

Прекратяване и дивергенция в пръстенните геноми.Затворената структура на много геномна ДНК опростява процеса на завършване на репликацията на цялата нуклеотидна последователност. Непрекъснатото нарастване на водещите и изоставащите вериги по кръговата матрица неизбежно води до подреждане на 3'-хидрокси- и 5'-фосфорилните краища на една верига или в началото на репликацията, или, в случай на двупосочна репликация, в средата на пръстена (прозрачност 14). Пръстените в тези точки на среща са свързани с ДНК лигаза, докато обикновено се оказват свързани по двойки и в бъдеще трябва да бъдат разделени в отделни геноми. Това се прави от топоизомераза тип II (прозрачност 15).

Терминация и дивергенция в линейната ДНК.С изключение на аденовирусната ДНК, където синтезираните ДНК вериги се инициират от протеинов праймер и шаблонната верига се копира напълно (прозрачност 16), във всички останали случаи е необходим РНК праймер за репликация, което създава специални проблемислед завършване на линейна дуплексна репликация на ДНК (прозрачност 17). Факт е, че след започване на синтеза на нова верига и последващо отстраняване на РНК праймера, новосинтезираната верига съдържа празнина в 5' края. Тъй като не съществуват методи за удължаване на 5΄-краищата на ДНК вериги, са необходими някои други методи за завършване на репликацията. Бяха предложени два начина.

Първо: предполага, че има ДНК вериги с прави повторения в краищата (прозрачност 18). След репликацията, двата допълващи се края на двата непълни дуплекса могат да се сдвояват и образуват линейни конкатемери с едноверижни прекъсвания.Останалите празнини могат да бъдат запълнени чрез удължаване на нишките в посока 3΄ → 5΄ и след това свързването им с ДНК лигаза или чрез директно свързване на допиращите краища с помощта на ДНК лигази с образуването на конкатемери. След разрязване на конкатемера със специфична ендонуклеаза се образуват изпъкнали 5' краища и ДНК полимеразата може да израсне по-къси вериги от 3' края.

Второ.Предполага наличието на къси обърнати повторения в края на всяка ДНК верига, поради което се образуват малки бримки (прозрачност 19). 3΄-краят на цикъла служи като праймер за копиране на нерепликирания регион. Поради специфично прекъсване в началото на обърнатото повторение се получава структура, която може да бъде разширена от 3΄-края, за да се възстанови оригиналната двуверижна терминална последователност.

Отбележете също, че всички ДНК полимерази, водещи комплементарен синтез, както в бактерии, така и в еукариоти, също имат екзонуклеазна активност в посока 3 "-5", което е обратната посока на синтеза. Те са в състояние, така да се каже, да се "обърнат" и да премахнат нуклеотида, който току-що са прикрепили. Това е много важен механизъм за елиминиране на грешки в комплементарния синтез. В крайна сметка грешка може да бъде открита само когато вече е направена. И веднага го поправете! ДНК полимеразите могат да направят това. Такава корекция не е необичайна, но е норма. Смята се, че без него, по време на репликация на ДНК от E. coli, 5-10% от нуклеотидите биха били неправилно прикрепени. Благодарение на корекцията, 1 грешка в тази ДНК се отчита за десет милиона базови двойки.

възстановяване на ДНК

ДНК е единствената клетъчна макромолекула, която е в състояние да елиминира (поправи) увреждане, което възниква в нейната структура. Освен това той кодира информация за механизмите на голямо разнообразие от репарационни процеси. Допълнителното сдвояване е в основата не само на репликацията на ДНК, но и на процеса на възстановяване на оригиналната структура на ДНК по време на възстановяването на увреждане, засягащо гръбнака на молекулата, модификации на една или друга база или несъответствие по време на рекомбинация (вижте по-долу). Едновременното увреждане на двете вериги на едно място и прекъсванията на двойни вериги често са смъртоносни за ДНК, тъй като такива дефекти се поправят само в редки случаи.

Най-честото разкъсване на гликозидни връзки между пурин и дезоксирибоза N (депуринизация) се случва с повишаване на температурата. Всеки ден в човешката клетка се извършват от 5000 до 10000 акта на депуринизация - това води до нарушаване на репликацията и експресията на гена. В допълнение, остатъците С и А могат да претърпят спонтанно дезаминиране с образуване на U и хипоксантинови остатъци, съответно; честотата на подобни събития е около 100 на геном – това води до появата на мутации.

Много промени в структурата на ДНК настъпват под въздействието на химикали, присъстващи в околната среда. Това са алкилиращи агенти (азотни съединения, алкилсулфонати, нитрозоуреи), които модифицират за предпочитане G-остатъци, съединения, които се вмъкват между съседни базови двойки и водят до появата на инсерции и делеции по време на репликация; бифункционални агенти, способни да образуват ковалентни кръстосани връзки между две ДНК вериги и да блокират тяхната дивергенция по време на репликация. Физическите ефекти са не по-малко разрушителни – поглъщането на Т или С UV светлина води до образуване на циклобутанови димери между съседните пиримидини; йонизиращо лъчение (космически лъчи) насърчава образуването на силно реактивни свободни радикали, които имат голямо разнообразие от ефекти върху ДНК; Рентгенови лъчи – причиняват едно- и двуверижни прекъсвания в ДНК, както и други увреждания, характерни за свободните радикали.

Има два основни метода на репарационни процеси:

Директна корекция на модификации или неправилни сдвоения, без да се изисква репликация за възстановяване на оригиналната структура;

отстраняване на нуклеотиди около несъответстващи или променени базови двойки и ресинтеза на това място чрез репликация.

ремонт чрез директно възстановяване на оригиналната структура.

Ако под въздействието на алкилиращи агенти - N-метил-N-нитрозоурея или N 1, N-диметилнитрозогуанидин, О 6 - метил или О 6 -алкил-заместени гуанинови остатъци се образуват в ДНК, тогава деалкилирането на такива остатъци става с участието на ензими - О 6 -метилгуанин -ДНК алкилтрансфераза, която катализира прехвърлянето на алкилови групи към сулфхидрилни групи на цистеинови остатъци на ензима, докато акцепторният протеин е инактивиран. Това е при бактериите и бозайниците.

Ако при облъчване на ДНК с UV светлина се образуват циклобутанови димери между съседни двойки пиримидинови бази, тогава ензимни (фотолиаза не присъства при бозайници) ги трансформират в мономери, когато разтворът е осветен с видима светлина в диапазона на дължината на вълната 300- 600 nm. Ензимът образува стабилен комплекс с пиримидиновия димер и използвайки енергията на погълнатата от него светлина, разрушава димера, без да разрушава ДНК вериги.

Ремонтирайте чрез подмяна на модифицирани остатъци.

Замяната на модифициран нуклеотид обикновено се извършва на четири етапа:

Етап 1... Ензимът разпознава този нуклеотид и срязва полинуклеотидната верига близо до него или разрушава гликозидната връзка между модифицираната база и дезоксирибоза. Разцепването на местата, в които е настъпила депуринизация или депиримидинизация, се извършва от ензимите AR (апуринова, апиримидинова) ендонуклеази. При възстановяването на N-алкилирани пурини и други модифицирани бази, ензимите играят ключова роля - N-гликозилазите, които разцепват гликозидната връзка между модифицираната база и дезоскирибоза (прозрачен 25)

Етап 2... Екзонуклеазата премахва модифицирания нуклеотид и/или съседните нуклеотиди, оставяйки малка празнина.

Етап 3... Изтритият участък се синтезира наново от 3'-OH-края, като се използва противоположната верига като шаблон.

Етап 4... Краищата на празнината, образувана в резултат на ремонта, са свързани за възстановяване на ковалентната цялост на ремонтираната верига (прозрачност 26)

Значението на възстановяването на ДНК.

Елиминирането на грешките при репликация е важно, тъй като повечето от щетите блокират трансфера на генетична информация към следващото поколение, а останалите, ако не бъдат елиминирани, ще се запазят в генома на потомците и ще доведат до драматични промени в молекулите на протеини, ензими необходими за поддържане на жизнените функции на клетката. Когато определени части от системата за възстановяване са повредени, клетките стават особено уязвими към определени химически и физически агенти. Хората с, например, ксеродерма пигментоза са много чувствителни към UV светлина и развиват различни форми на рак на кожата дори при много малко излагане. слънчева светлина... Клетките на такива хора носят мутация в гените RAD, която се проявява във факта, че те имат нарушена способност да разцепват пиримидиновите димери от облъчената с UV лъчи ДНК. Заболяването може да бъде причинено от мутация в един от най-малко девет гена, което показва доста сложен механизъм за възстановяване на ДНК, съдържаща тиминови димери при хора.По правило заболяването е свързано с невъзможност за разцепване на тиминовите димери. Ако към облъчените клетки в културата се добави ензим с тимин димергликозилаза и АР ендонуклеазна активност, тогава UV увреждането може да бъде елиминирано.