ДНК репликация. Ензими за репликация. Биологичната роля на репликацията. Регулиране на механизмите за репликация на ДНК за регулиране на репликацията на нуклеинова киселина

Подробно внимание на молекулярните механизми за регулиране на репликацията на ДНК е извън обхвата на книгата, така че ще се ограничим до няколко коментара по този въпрос и ще обсъдим само механизма за регулиране на регламента в Е. coli, включително бактериални плазмиди, които са директно свързани с функционирането на плазмид вектори в бактериални клетки.

Синтезът на ДНК е тясно свързан с други процеси, приготвят клетъчното делене, тъй като прехвърлянето на необходимата генетична информация за родителските клетки е дъщерно дружество за низходящи клетки е от жизненоважно значение. Наличието на излишна генетична информация неблагоприятно влияе върху клетъчната жизнеспособност, докато нейният недостатък, който възниква поради неуспеха на ДНК, води до фатален ефект поради липсата на жизненоважни гени. Въпреки това, процесът на предаване на генетична информация от родителските клетки чрез дъщерно дружество в eUKaryotes не се ограничава до просто намаляване на ДНК хромозомите. Така, за насекоми на много видове, присъствието на гигантски полиненнахромозоми, които възникват в резултат на множество кръгове на репликация на ДНК на първоначалните хроматиди, които не са придружени от тяхното несъответствие.

Полистенция Хромозомата представлява обширен клас генетични явления, свързани със селективна излишна репликация ( животно) или покой за индивидуални генетични EUKARYOTA LOCI. Ярък пример от този вид е промяната в броя на рибозомните гени на РНК при животните. Амплификацията на RRNA гена в амфибийските ооцити се появява чрез образуването на техните екстрахромозомни (екстрахроммични) копия под формата на пръстенни молекули от рибозомални (p) dNA, които са допълнително възпроизведени от механизма на "подвижен пръстен". В същото време, само една от клетките на RDNA повтаря се усилва във всяка клетка, така че амплификацията на RDNA на едно повторение по някакъв начин потиска процеса на амплификация върху други и всички формирани повторения на един оокит са идентични, но се различават от множествата амплифицирани RDNA на други ооцити. Строг етап и тъканна специфичност, както и селективно усилване само на една RDNA повтаря точка до наличието на фини регулаторни механизми на процеса на репликация и в този случай.

Характерни примери за увеличаване на броя на гените, дължащи се на тяхната избирателна репликация увеличение RRNA гени и промени в броя на гените, които определят стабилността на клетките към лекарства. В първия случай загубата на част от RRNA гена в Drosophila в резултат на делеция е придружена от постепенно намаляване на техния брой, докато във втория случай клетките, разположени при условията на селективно действие на лекарството за тях За тях увеличава броя на копията на гените, необходими за нейната неутрализация. По-специално, това е типично за дихидрофолатидния ген в присъствието на метотрексат. Предполага се, че основата на промяната в броя на копията на такива гени е механизмът на неравномерно омрежване.

Репликацията на хромозомите на бактериите е тясно конюгирана с клетъчен метаболизъм. Например, скоростта на иницииране на нови репликационни кръга зависи от скоростта на растеж на бактериалните клетки и в клетките на бързо отглеждане на бактерии могат да се съдържат хромозоми с няколко работни репликативни вилици, въпреки че са необходими само две за репликиране на една бактериална хромозома, инициирани в единствения регион на началото на репликацията (ORI) и се разтваря в противоположни посоки. Това позволява бактерии при благоприятни условия да струват по-малко време за генериране, отколкото за пълната репликация на бактериалната хромозома. Очевидно е, че за да се поддържа стриктно наредена природа на репликацията, трябва да има фини механизми за регулиране на репликацията на нивото на започване на нови кръгове. Такива механизми наистина съществуват.

Най-добре проучени са механизмите за регулиране на синтеза на ДНК в Е. coli, включително механизми за контролиране на броя на копията в малък плазмид Е. coli cole1, който ще бъде обсъден по-подробно поради значението на тези явления за генното инженерство.

Репликацията се случва след преминаване на ограничителната точка или начало

Репликацията се регулира в етапи и се координира с началото на митоза

Репликацията възниква при иницииращи точки, които могат да имат специална първична структура, специфична позиция или разположени в ДНК на определени разстояния

Започването възниква само в разрешените точки, способни на репликация

Чрез изпълнение на функциите си преди следващия цикъл, точките на започване на репликация не могат да бъдат използвани повторно

Кога клетки Анализира държавата атмосфер И те решиха да се присъединят към цикъла на разделяне, преминават към G1 / s, и започват да репликират ДНК. Как клетките се комбинират и активират факторите, необходими за репликацията на ДНК? Какви механизми за контрол гарантират, че клетката само веднъж репликира ДНК и само веднъж в цикъла?

Въпреки че все още не е възможно да се даде пълноговори на тях въпросиВ резултат на идентифициране и анализиране на последователност от дрождев хромозомален ДНК, способен на независима репликация, се получава много информация за самия процес на репликация на ДНК. Тези последователности в хромозома, наречени автономно репликиране на последователности (ARS), са част от репликацията точки. Инициирането или началната точка (репликация) е част от ДНК последователността, върху която започва репликацията.

При свързваща мая, но не повечето други организми, Репликационните точки са представени от малки консенсусни последователности. При сливането на дрожди тези точки заемат големи части на ДНК, богати на двойки, но те не се различават в определена структура. Останалите еукариоти на началната точка на репликация са наредтелно разположени, в съответствие с разпределението на генома на протеините, не е свързано с ДНК.

За да се гарантира навременна дублиране на геномаХромозомата трябва да има достатъчен брой точки за репликация. Бактериите за репликация на единствения пръстенна хромозома изискват само една начална точка, обаче, еукариотите, които имат голям геном, разпределен в много линейни хромозоми, трябва да бъдат много точки от началото на репликацията. Свързващи дрожди, чийто геном е около 13 MB, в 16 хромозоми има около 400 точки от началото на репликацията.

Това създава няколко проблема, свързани с регулиране на процеса на репликация. Функционирането на точките за репликация трябва да бъде координирано с клетъчния цикъл по такъв начин, че репликацията да започне само по време на S фазата. Трябва да има пълна увереност, че репликацията е завършена преди клетъчния преход към митоза. Всяка от точките на началото на репликацията трябва да функционира само веднъж, за да се гарантира, че ДНК се възпроизвежда само веднъж на цикъл.

В продължение на целия клетъчен цикъл, 0rc е свързан с точката на започване на репликация върху хромозомата.
В рамките на кратък период от време, от късна митоза към G1, протеините, които активират репликацията, също са обвързващи до точката на самото начало.
CDC6 и CDT1, което от своя страна активира хексаменалния хеликоптерния комплекс (MSM2-7).
Този етап завършва отстраняването на блока за репликация и монтажа на пред RC.

Топ точки репликация Асоциират се факторите, необходими за активиране на репликацията и започване на синтеза на ДНК. Започването на репликацията на ДНК възниква само в тези точки, които съдържат свързани фактори и които следователно се отнасят до разрешените точки. Въпреки това, във всеки кръг от репликация на ДНК в процеса, е включен ограничен набор от потенциални начални точки, присъстващи в хромозомите. Освен това, тъй като различните разрешени първоначални точки се активират по различно време, инициативите се появяват и чрез различни интервали от време. Например, някои точки се активират в ранната S-фаза, докато други отиват в това състояние по-късно.

Не е известно от това. временно факторНо изглежда, че местоположението на специфичната точка на началото на репликацията върху хромозомата определя времето на неговата обида.

Виждането на репликацията да започне, в точката трябва да се формира началото prisribitive Complex. (Pre-rc). В резултат на генетични проучвания на дрождите и биохимичните изрази върху екстрактите на ксенопус, екстрактите на яйцата на Xenopus, е установено Pre-RC модул. Процесът започва със свързване от ДНК на комплекс от шест протеина, който се нарича комплекс, който разпознава стартовата област на репликация (комплекс за признаване на произход на ORC). Този комплекс бележи потенциална точка на репликация, но не е достатъчно да се активира. Той служи като платформа за свързване на два по-консервативни протеина: CDC6, който се отнася до семейството на AAA + Atpase и CDT1. (Много протеини с домейн на атпанзия използват ATP енергия за извършване на работа.)

Тогава комплексът се присъединява към тях поддържане на минихромозома (Минихрозомен поддържащ комплекс, MSM), който е пръстенова структура, състояща се от шест роднини, които също принадлежат към голямото семейство AAA + Atpaz. МСМ комплекси присъстват в излишък и разпределени извън началната точка на репликация. След свързването на MSM, ORC и CDC6 стават незадължителни компоненти и предварителен RC преминава в състояние, способно да активира. Редът на събитията, който се случва при сглобяване на предварителната RC в точките на връщане на репликацията, е схематично показан на фигурата по-долу.

Предварително RC монтаж Той е ограничен до интервала между края на М-фаза и ранната S-фаза, която се обяснява със следните причини. Първо, в клетката нивото на протеините на CDC6 се контролира по такъв начин, че да присъства само през този период от време. При отсъствие на CDC6 протеин, MSM протеинът не е свързан с точката на началото на репликацията. Второ, при METAZOA протеинът на CDT1 се регулира отрицателно от друг протеин, геминин, който блокира дейността си във всички периоди, с изключение на прозореца в G1. И накрая, сглобяването на самата пред RC е ограничено от активността на митотичния CDK-циклинов комплекс.

Субстратите за този комплекс са субединици Orc., CDC6. и MSM.. Когато фосфорилирането, CDC6 е инактивиран и фосфорилирането на MSM протеин в S-фазата го кара да се разцепи от ДНК. Следователно, предварителната RC може да бъде оформена само с ниската активност на CDK-цикличния комплекс. Това е типично за разликата между нивата на висока активност на митотичния CDK-циклинов комплекс в М-фаза и в S-фазата, когато тя се увеличи отново, допринася за активирането на репликационната точка.

Как е точката започнете репликацията отива от прецизатив в репликативното състояние? За такъв преход е необходима образуването на много допълнителни протеинови комплекси и процесът е под контрола на две кинази, CDK-циклин комплекс и CDC7-DBF4 (DDK). По този начин, активността на CDK-циклинов комплекс координира процесите на репликация и клетъчния цикъл. В този случай координацията може да бъде координирана като отрицателна (предотвратяване на монтажа преди RC и по този начин, функционирането на точките на репликация) и положителен характер (насърчаване на активирането на репликационните точки). Въпросите, които очакват отговора си, включват въпрос относно киназните субстрати, което насърчава инициирането на репликацията.

Ако са комплекси CDK-циклин Осигуряване на координация на процесите в целия цикъл, ДДК действа на нивото на отделни точки, иницииране на синтеза на ДНК. Най-известните субстрати на тази киназа включват самите MSM-протеини. Интересното е, че точката мутация в гена на МКМ5 отменя необходимостта от присъствието на ДДК. Това предполага, че фосфорилирането води до промяна в потока на MSM протеина, което е причината за започване на репликация. Въпреки това наличните данни сочат, че тези промени са изключително незначителни. Показани са процесите за контрол на репликацията на ДНК с участието на CDK и DDK.

Вероятно ограничаване на процеса на иницииране репликация В някои начални точки, свързването на CDC45 протеина, за който са необходими както CDK-циклинов комплекс и DDK. Свързването на този протеин, придружен от образуването на допълнителен комплекс, наречен джини, води до спиралата на ДНК спирала в началната точка, поради активирането на MSM комплекса, действащ като хелиак. По този начин МСМ се обръща от фактора на сглобката, участващ в образуването на пред-Rc в ензимната хеликоптер, която е част от удължения комплекс. Устойчивостта на ДНК двойна спирала в точката на начало на репликацията води до образуването на единична ДНК, която се свързва с специфичен RPA протеин, свързан с SSDNA свързващи протеини (SSDNA свързващи протеини).

На свой ред, rPA протеин Насърчава свързването на алфа Praimaz / ДНК полимеразния комплекс, който инициира синтеза на ДНК. MSM и CDC45 комплексът се движи по ДНК, образувайки разширяващ се репликативен щепсел, който образува голяма реплика, съдържаща главно ДНК полимераза 6, а не полимераза a. Процесите за иницииране на ДНК репликация са представени на фигура по-долу. При поддържането на функционирането на повторенията и защитата на ДНК в областта на репликативната щепсела от повреда, контролни точки и системите за ремонт на ДНК.

Възможно най-скоро MSM. Те се отдалечиха от точката на връщане на репликацията, се счита за "използвана" и не може да се активира отново, докато следващата М-фаза приключи, докато в началната точка се образува предварителен RC. Тъй като S-фазите преминават, MSM се отстранява от хроматин. Заедно с това, при преместване на репликативни вилица, връзките се свързват заедно преди митоза на новосформираните кърмещи хроматиди. По този начин завършването на S-фазата се свързва с образуването на необходимите структури за правилното разделение на хромозомите в митоза, което показва образуването на връзки между различните фази на клетъчния цикъл.

Функцията на началните точки на репликацията също се регулира на нивото на цялото хромозоми. Препоръчително е да се припомни, че в клетка, използвайки нуклеози, е опакована в хроматин, която налага редица структурни ограничения върху него. Това обстоятелство може да повлияе на временната организация на репликацията; Например, не на всички точки, започнете в S-фаза репликация по едно и също време. В някои случаи относителното време за активиране на точките за активиране на началото на репликацията може да бъде определено не на самия въпрос и местоположението му върху хромозомата. Точките, разположени близо до транскрипционно-активния Eukhromatin, се инициират по-рано от тези, разположени в близост до транскрипцията и неактивен хетерохроматин, които обикновено се инициират в късната S-фаза.

Лекция 3. Репликация на различна ДНК и нейното регулиране и обезщетение

Уотсън и Крийк предложиха за удвояване на ДНК, водородните връзки държат спираловидните дуплекс заедно и несъответствието между веригите трябва да се случи. Те също така изразиха идеята, че всяка верига от дуплекс служи като матрица в синтеза на безплатната верига и като резултат се образуват два двойки вериги, всеки от които е само един е родителят. Уотсън и Крийк приемат, че репликацията на ДНК се извършва спонтанно, без участието на ензимите, но се оказа неправилно. Въпреки това, идеята, че ДНК се удвоява чрез последователна връзка на нуклеотидите в съответствие с правилата на допълнението, посочени от всяка спирална верига, позволява на концептуалния проблем на точното възпроизвеждане на ген.

Тъй като това предположение е изразено, матрицата на репликационния механизъм се потвърждава от множество данни, получени като in vitro и in vivo за различни организми. Според репликацията на модела на всички двуверижни ДНК полу-сървъри. Доказателството за полу-репарвативния механизъм е получено през 1958 г. от учени с Месалсън и стомана (EM). Първоначално те са отглеждали бактерии за дълго време на среда, съдържаща тежки азотен изотоп (15 N), който е включен в ДНК и след това ги прехвърля в среда, съдържаща конвенционален светлинен азотен изотоп (14 N). След репликация дъщерната ДНК от първото поколение беше фракционирана чрез плътност. Оказа се, че цялата дъщерна ДНК е хомогенна и има плътност, междинен между плътността на тежка и лека ДНК. Следователно една верига от дъщерните молекули на ДНК съдържат 15 N, а другият 14 N, който съответства на полу-репарвативния механизъм. Има ли алтернативни методи за репликация на двуверижна ДНК (консервативна и диспергирана) - неизвестна. Така че, след един кръг от репликация една верига във всяка от двете дъщерни ДНК е родител, т.е. консерватив, а другият отново се синтезира.

Репликация на едноверижна ДНК в вирусите. Ако генът представлява едноверижна ДНК (както при някои вируси), тази единична верига служи като матрица за образуването на безплатна верига, с която образува дуплекс, и след това дуплексът е синтезиран или детски дуплекси, или единични верижни копия на една матрична верига. Репликацията на генетичния материал на вируса обикновено се извършва с участието на ензими на клетката гостоприемник. При някои вирусни ДНК молекули, неговите ДНК копия също са синтезирани - с помощта на клетъчно или кодирана ДНК полимеразен вирус. Тези ДНК копия се използват по-късно при сглобяване на вирусни частици. Репликацията на ДНК вирусите се появява или в сърцевината на клетката гостоприемник (херпес вирус), или в цитоплазма (poksviruses).

Репликация в прокариот. Намаляване на ДНК (Процесът, при който информацията, кодирана в последователността на основата на молекулата на основната ДНК, се предава с максималната точност на дъщерната ДНК), изпълнява специален ензим за ДНК полимераза. Кацането Този ензим на една от ДНК нишки се предшества от строго локализирана пръстенна междина, ако ДНК е пръстен (в бактерии) и известно разделение на крайната част на неговата гигантска спирала. Отбелязваме, че ДНК полимеразата може да седи на всеки от двата края на спиралата, но задължително на конеца, че този край е 3 "конференция (независимо дали е" кодиране "или" защитна "нишка). Промоция на ензима "Матрицата" майчината нишка винаги върви в посока на 3 "-concar до 5" - съдържание. От това следва, че "допълнителният" синтезиран на тази матрица, новата ДНК нишка ще започне с нейната 5 "- конференция и увеличаване на Посока на бъдещето му 3 "- край. Тези две посоки не могат да бъдат объркани. В случай на съмнение е достатъчно да се помни, че увеличаването на новата пластина се извършва чрез постоянно присъединяване нуклеотиди Вече носеща фосфатна група, свързана с 5 "деоксирибоза-въглерод. Следователно до предишното, тя вече стои на мястото си с нуклеотид, трябва да се свърже с една група, свързана с 3" деоксирибоза-въглерод. И това означава това разширение нова нишка ДНК отива в посока 5 "-3" . Целесъобразно е да се припомни, че работата на производството на ДНК полимераза се извършва поради енергията на химическата почивка между първия и втория фосфати на съответния нуклеосидетрифосфат - прекурсора на прикрепения нуклеотид.

Сега преминете към добавяне и изясняване. За да започнем, в клетката на чревната пръчка (Е. coli), а не една, но колкото три ДНК полимерази. Те се различават значително един от друг чрез молекулно тегло и в броя на молекулите на всеки от тях, съдържащи се в клетката. И чрез тяхната роля в процеса на намалена ДНК.

Исторически, първият беше открит и изчистен ДНК полимераза I. (Ензим Cornberg). След това се появи ДНК полимераза II и III, Молекулни тегла от тези три ензими, съответно, 109, 90 и 300 kDa и тяхното представяне в една клетка: 300, 40 и 20 броя. Разликата в функциите ще се види от по-нататъшно.

Описание на първия етап на Reduplication Да започнем с факта, че първоначалното разделение на края на ДНК-двустателката молекула се извършва с помощта на специален протеин "Топоизомераза". (прозрачен 6) в началната точка на репликацията - ORI (произход - началото на репликацията).

Структура на репликационните точки. ДНК фрагменти, носещи точка от началото на репликацията, изолирана от Е. coli и някои плазмиди, както и от дрожди и редица еукариотни вируси. В някои случаи позицията на началото на репликацията има такава нуклеотидна последователност, че дуплексът приема необичайна конфигурация, коловоуработващите протеини разпознават протеините, участващи в инициирането. Естеството на взаимодействието между точката на започване на репликация и протеини и механизма за иницииране като цяло не се изследват.

Така че, топоизомеразата се движи по двупосочна молекула, отслабвайки водородните си връзки толкова много, че тези връзки преминат на къса терминала вече при температура от 37 ° С. След топоизомеразата, майката ДНК седи и започва да се движи по друг протеин ДНК заглавия, Кой ще трябва да играе ролята си по-късно. След това специалната РНК полимераза, работеща само от края на ДНК нишки, посочени "Прайдз" изгражда много къса рибонуклеотидна верига (наречена име "Primera") Допълване на началото на ДНК нишката. В бактериите е само 5 нуклеотида, а еукаротов е около 40. (на фиг. 28, всички праймери са показани с тънка линия, а всички ДНК нишки са мазнини.)

Само сега, незабавно за праймера на същата ДНК нишка (ние сме съгласни, за простота, тя е "първата") ДНК полимераза, която може да започне да изгражда допълнителни ДНК нишки само от PriMer, като се присъедини към него ("танци от печката") . Това са ДНК полимераза III, най-големият, състоящ се от 6 субединици и в неговата функция е дом - тя ще доведе "допълнителния синтез" на ДНК на тази първа ДНК майчина линия до самия край. Първоначалното движение на тази ДНК полимераза е ограничено до 1-2 хиляди нуклеотиди на първата нишка (в еукариотов - само 200 нуклеотиди).

Втората конец на майката (дори празна) се формира заедно с първата нишка на "щепсел на Reduplication".

Между хелихеза и ДНК полимераза III се образуват някои парцел на голи 1-ви нишки. Втората нишка все още не е обхваната. Тези две нишки след грижата на Хеликаз могат да се върнат отново. Така че това не се случва, тясно зад хеликолеката на първата нишка седят четири, така наречени "ДНК свързващ протеин." Те не приписват други функции, с изключение на защитата срещу възстановяване на ДНК двойно спирали близо до върха на вилицата ...

Преминаване към горната част на вилицата на желаните нишки на майчините ДНК тандемни хаос-ДНК-свързващи протеини - ДНК полимераза III спира (виж фиг. 28). Топоизомеразата листа по-нататък по двуизмерната двойна ДНК, а HELPOS разкъсва сахаро-фосфатната връзка на втората нишка. Двойните спирали са запечатани на парцела в непосредствена близост до вилицата, завъртанията на двойната спирала се разпространяват, първата ДНК нишка заедно с протеините, които седяха върху него, въртяха около неговата ос, и около тази нишка се превръща и нарязана на 2nd нишки, временно свързани с хеликоптаза. Тази част се нарича "фрагмент от разпоредбата" - от името на учен, който намери появата на такива фрагменти по време на намаляването. След отстраняване на напрежението на нишката на двойната спирала на майчината ДНК, те отново могат да започнат да се разпръскват. Но преди това, от края на фрагмента, друг Praimaz започва да изгражда нов рибонуклеотиден грунд върху него. След това gelpasses освобождава фрагмент и върви напред и специален ензим "Лигаза" Увеличава началото на фрагмента от разпоредбата за предишното място - до втората нишка на майката ДНК. Имайте предвид, че лигазата (m \u003d 96 хиляди) в клетката Е. coli е представена от най-многото население - около 200 молекули. Какво следва, че не извършва произволни "ремонтни" произведения, но е пълноправен член на съвкупността от ензими, които осигуряват редузия на ДНК (като стойността на преждата за хирурга).

Когато грундът е готов, пред него, по посока на 5-та "конституция на 2-ра майчината ДНК, ДНК полимераза I седи. Конструкцията на конеца, допълваща този фрагмент на втората нишка, отново в посока 3" - 5 ", преброяване на тази нишка. ДНК полимераза I стига до края на фрагмента на кетъринга и премахва. Това завършва 1-ви етап от редукцията (фиг. 28).

Междувременно, праймерът, оставащото в началото на първата нишка, се унищожава от определена "рибонуклеаза H", - ензима, нишката на РНК, разположена в комплекса ДНК нишка. На своето място, ДНК полимераза II поставя "правилни" дезоксирибонуклеотиди. В същото време, топоизомераза, хелиап и за тях и ДНК полимераза III се движат напред.

Започва 2-ри етап от намаляването. Щепселът за репликация също се движи, в непосредствена близост до част от двойната двупосочна ДНК на майката и цялата синтезираща тандем спира. Gelpaste отново намалява втората нишка, образувайки втори фрагмент от предоставянето. Точно както преди, грундът се създава на изрязания (временно) край на фрагмента, ДНК полимераза I "SID" е "седалка" и започва да копира втория фрагмент от предоставянето, т.е. 2-ра нишка на майчината ДНК. Разликата между втория етап само ще бъде, че по пътя на тази полимераза, праймерът, който остава от копирането на 1-ви фрагмент от предоставянето. Но ДНК полимераза I, за разлика от всички останали ДНК полимераз, има и 5 "-3" екзонеусклеза активност, т.е. в посока на движението му. Тя унищожава грунда и е на мястото, от което е започнало копието на 1-ви фрагмент от предоставянето на своя предшественик. Тя остава само за да се завърти с фосфодитарната връзка. Тези две парчета нови комплементарни нишки. Естествено, това прави везделната ДНК лигаза.

Характерни примери за увеличаване на броя на гените, дължащи се на тяхната избирателна репликация увеличение RRNA гени и промени в броя на гените, които определят стабилността на клетките към лекарства. В първия случай загубата на част от RRNA гена в Drosophila в резултат на делеция е придружена от постепенно възстановяване на техния брой, докато във втория случай в клетки, разположени при условията на селективни токсични действия за тях лекарствена подготовкаБроят на копията на гените, необходими за неутрализиране, той се увеличава. По-специално, това е типично за дихидрофолатидния ген в присъствието на метотрексат. Предполага се, че основата на промяната в броя на копията на такива гени е механизмът на неравномерно омрежване.

4.2.1. Иницииране на ДНК репликация в E. coli и нейното регулиране

Хромозомната репликация на ДНК чрез бактерии играе ключова роля в техния жизнен цикъл. По време на този процес микроорганизмите намаляват генома си и произтичащите от тях дъщерни дружества отиват в дъщерни дружества. Високата точност, с която тези бактерии упражнява такива процеси показват наличието на специални механизми за тяхната координация и контрол.

^ Структура на началото на репликацията oric. Хромозом Е. coli съдържа единствения репликация Старт (Произход) се нарича окисна които се случва иницииране на репликацията (фиг. I.47, но). Размерът на минималната площ на началото на репликацията, която осигурява автономна репликация на хромозомата е 258 bp. (позиция 11-268 на фиг. I.47). Сравнението на основните структури на регионите на началото на репликацията на различни ентеробактери показва, че техните последователности са представени от къси консервативни зони, които се смесват с потапящи се сегменти, чиито дължини, обаче, са силно прозвучени. Консервативните обекти се оказаха, че са свързващите места на регулаторни протеини, разделени от дистанционни последователности. Окис Съдържа пет консенсус 9-нуклеотидни свързващи места за инициатора на ДНКА (нестандартни повтаряния), наречени кутии DNAA. Във всички ентеробактерии площта на началото на репликацията съдържа 9-14 GATC места, позицията на осем от които е консервативна.

В лявата страна окис Има богата зона, съдържаща три подобни последователности от 13 нуклеотида, всяка от които започва с GATC. В клъстерът тук е локализиран тук, който заедно с лявата 13-нуклеотидна последователност образува нестабилна ДНК спирална област ( ДНК поразителен елемент). Тази ДНК секция може да бъде заменена без загуба на функция към подобен нуклеотиден състав, но с различна нуклеотидна последователност.

Окис Съдържа местата за свързване на протеини огъване ДНК, IHF (интеграционен гостов фактор) и FIS (фактор за стимулиране на инверсията). И двата протеина изглежда помагат на ДНК инициатор да се отпусне ДНК.

Димитърът на ICIA протеин, състоящ се от субединица с молекулно тегло 33 kDa, специфично се свързва с богати 13-размерени повторения. Функцията на този протеин е неизвестна, както и функцията Rob протеин, която специфично взаимодейства с 26-нуклеотидния сайт в дясната част на ДНК-кутията R4. ДНК в близост до Rob сайт открива огъването, което е по-изразено в молекулите напълно метилирани от язовир метилтрансфераза (виж по-долу). При такава напълно метилирана ДНК, хистон-подобни H-NS протеин взаимодейства, свързващото място се припокрива с ограбния сайт. Това взаимодействие влияе върху функционирането окис.

Фиг. I.47. Структура на региона на началото на репликацията на хромозома Е. coli ( но) и схемата за иницииране на нейната репликация ( б.)

HOBH - протеин, взаимодействащ с метилиран едно верига ДНК поле на репликация (свързване на хемиметилиран произход)
^ Протеиновите функции на ДНКА. DNAA Protein играе ключова роля в сглобяването република- Многокомпонентен протеин комплекс, упражняващ двупосочен синтез на ДНК. Протеинът разпознава областта на започване на репликацията и привлича оставащите протеинови компоненти на република до мястото на монтажа.

^ Стартиране на иницииране на синтеза на ДНК окис. Монтаж източник комплекс Тя започва с взаимодействието на ДНКА протеин с DNAA-кутии R1-R4 и m (виж фиг. I.47, \\ t б.). За успешното преминаване на следващите етапи на република сглобяването, ДНК протеин трябва да бъде в комплекса ATP и да взаимодейства с свръхестествено окис. С помощта на електронен микроскоп, изходният комплекс се намира под формата на компактна елипсоидна структура, съдържаща 20 DNAA мономери, които се затварят окис. Комплексът от източника има изключително поръчана структура.

В присъствието на АТР във висока концентрация (5 mm), изходният комплекс се превръща в отворен комплекс. В този комплекс има частичен график на богати 13-нуклеотидни повторения, разположени в лявата страна окис. При 37 ° или по-горе, единственият DNAA протеин може да се рестартира ДНК. За образуването на отворен комплекс при по-ниски температури се изисква участието на протеина за структуриране на HU или фактора на интеграция на IHF домакин бактерията. В отворения комплекс, в дясната страна се намират малки площи от планираната ДНК окис Между DNAA-кутии R2 и R4, които се считат за кацане на сайтове Helikaz.

DNAB Protein е репликативен щепсел Helichaze и влиза в отворения комплекс с образованието спомагащ се Комплекс I., взаимодействащи с едноверижни зони с частично работеща ДНК. Такива зони се получават от DNAA протеин, който измества SSB протеина от съответните места. DNAB е част от комплекса за класификация I под формата на хексамер формира комплекс с шест DNAC мономера, всеки от които обвързва една ATP молекула. В този комплекс, хеликарната активност на DNAB протеина е блокиран. Освобождаването на DNAC от комплекса се случва в резултат на АТФ хидролиза. Последствията от това е активирането на Helicase на DNAB и правилното му местоположение в комплекса. Комбинацията от тези събития превръща реминириращия комплекс I комплекс за напомняне II..

Heliacia трябва да започне да функционира в началото на репликативния щепсел в дясната страна окис в близост до кутии от DNAA R2, R3 и R4. За да направите това, тя трябва да бъде преведена от мястото на първоначалното си влизане в комплекса до точката на началото на репликацията. Предполага се, че транслокацията е свързана с изключение на АТР от DNAC протеиновия комплекс, който е придружен от активирането на хеличаса.

В първичен комплексheliac Design DNAB взаимодейства с DNAG-Praimaz, който играе ключова роля за осигуряване на започване на репликацията окис. И двете от тези ензими осигуряват взаимно свързване на две репликативни вилици, движещи се в противоположни страни. В клетъчна система при ниски концентрации на Primase, репликацията става еднопосочна и не може да бъде инициирана окис. В първичния комплекс, наличието на DNAA протеин вече не е необходимо и може да се използва повторно след освобождаване от комплекса, за да се инициира репликация на друг окис. Смята се, че по време на координираното сглобяване на две репликативни вилици в един от тях се синтезира грунд, който става семе в синтеза на водещата верига с друго репликативно вилица, движеща се в обратна посока. Praimaz в първичния комплекс работи в съответствие с механизма за разпространение. След синтеза на праймерите, той оставя репликативния вик и се заменя с нова молекула молекулация по време на образуването на следващия фрагмент от предоставянето.

При формирането на репуси във всяка репликативна вилица, ATP-зависимо образуване на димерния комплекс на ДНК полимегал на III е свързан с 3 "-Contamines на праймери (плъзгаща се скоба, виж по-горе). Ако не успяват праймерите, придружени от двупосочен синтез на водещ и изоставащ координиран синтез. ДНК вериги. В безцветната система на началото на началото на синтеза на задвижващите вериги се локализира в окис в близост до кутии от DNAA R2, R3 и R4.

^ Механизми за контрол на започване на репликация in vivo. Започването на ДНК репликация в Е. coli се регулира най-малко на три нива: 1) инициирането се синхронизира с клетъчния цикъл; 2) Синтез на ДНК във всеки регион на начало на репликация в клетъчния цикъл се инициира само веднъж; 3) започване възниква синхронно във всички области на началото на репликацията, присъстваща в това бактериална клетка. Установено е, че синтезът на ДНК започва след масата на бактериалната клетка за един регион на началото на репликацията достига определена стойност, наречена индикат за претегляне (Инициираща маса). Като основен двигател на ритъма (Pacemecker), който играе ключова роля в наблюдението на инициирането на репликацията, в момента се разглежда от протеина на ДНКА.

Потискането на синтеза на протеин in vivo е придружено от завършването на вече инициираната ДНК синтеза на фона на прекратяването на новите кръгове за иницииране. Подновяването на протеиновия синтез води до започване на репликация след периода на забавяне в едно генериране на клетки. В присъствието на всички необходими протеини, инициирането е чувствително към рифампин - специфичен инхибитор на бактериална РНК полимераза, която показва зависимостта на инициирането на синтеза на нетранслирана РНК.

Ролята на оричната топология при започване на репликацията . Топоизомераза I и топоизомераза II (ДНК Гираза) поддържат бактериална хромозома в отрицателно положение на свръхчленяване. Приблизително половината от надзорните органи се неутрализират чрез хистонично като HU, IHF и FIS протеини, докато оставащото нарастване на бактериалната хромозома улеснява транскрипцията, репликацията и специфичната за място рекомбинация. Предполага се, че бактериалната хромозома се състои от 40-50 контролирани домейни с 25 на дискрита с 1 mete. ДНК. Понастоящем няма точни данни за топологичното състояние. окиснеобходими за започване на репликация от Е. coli. Известно е, че мутациите в гена на топоизомераза топа. Потискане на чувствителни към температурата мутации дуаа.(TS). Предполага се, че в тези мутантни щамове топологията окис Променен по такъв начин, че да позволява да се започне репликация с по-малки вътреклетъчни концентрации на DNAA протеин. В допълнение, значението на определено топологично състояние окис Да се \u200b\u200bинициира, показва факта на започване на мутантни бактерии с променения геном gyrb.(TS)кодиране на B-субединица на ДНК гириаза.

Активиране на репликирането на транскрипцията. В случай, че свръхпиоризацията на minichromosa или плазмида, съдържаща окисне е достатъчно да се инициира тяхната репликация, инициирането може да настъпи с едновременната транскрипция на ДНК в околността окис. Промяна на топологията окис В този случай може да се извърши от образованието R-loops. (ДНК РНК хибрид в двойно-верижна ДНК) или поради транскрипция, като такъв, в който локален положителен суперспиринг на ДНК се осъществява преди транскрипцията РНК полимераза и след като е отрицателна. Това улеснява образуването на отворени комплекси при иницииране на синтеза на ДНК.

^ Ролята на протеинаДуаа. В регулиране на започване на репликацията. ~ 60 минути е необходимо за бактериите да репликират хромозомна ДНК, разделяне на дъщерни дружества и подготовка за ново разделение. Следователно, клетките с времето на генериране в по-кратък период от този период (например при повишени температури върху богати хранителни носители) трябва да инициират репликация на хромозома, предназначена за последващи разделения, докато се завърши предишният кръг. По този начин една отделна клетка може да съдържа репликираща хромозома с множество точки на репликация. В същото време инициирането на репликация върху множество региони на начало на възпроизвеждане се случва едновременно.

Суперпродукцията на ДНКА в бактерии води до рязко увеличаване на честотата на повторенията, без да се променя общата скорост на синтеза на ДНК, което показва ДНКА като положителен регулатор на този процес. Сред моделите, обясняващи регулаторния механизъм на ДНК протеин, моделът на DNAA получи най-високо разпределение. В съответствие с този модел целият ново синтезиран DNAA протеин е свързан (Titrated) DNAA кутии окис хромозома. Веднага след като броят на инициаторните молекули надвишава броя на вътреклетъчните DNAA-кутии (всички кутии на ДНКА са включени в протеин), се инициира ДНК синтеза. След започване на инициирането на едно окис Наблюдава се освобождаването на DNAA молекули, рязко увеличаване на нейната вътреклетъчна концентрация и синхронното иницииране на ДНК синтеза върху други налични области на репликация. В същото време, сдружението с мембраните на първата окис Го предпазва от използване в реинтивиране.

Ролята на метилиране на язовира при започване на синтеза на ДНК. Както бе споменато по-горе, язовир метилтрансфераза Е. coli модифицира резиденцията в последователности 5 "-gatc. В резултат на репликацията на ДНК молекулата, тя временно се превръща в напълно метилирана молекула до метилирана една верига, която позволява на клетката да разпознават новосъздадената ДНК. Местоположение на язовирни места на клъстери Б. окис Enterobacteria е много потребител (виж фиг. I.47, но). Не-метилиран или полу-метилиран плазмидна ДНК в клетките на язовирните мутанти не се възпроизвеждат, въпреки че служи като субстрат в система за репликация без клетка. Репликацията на хромозомна ДНК на язовирните мутанти започва окисВъпреки това, контролът на репликацията е счупен, който се проявява в асинхронна репликация на множество окис. Оказа се, че само половин метилиран, но не напълно метилиран или не генериран окисДНК специфично се свързва с фракцията на E. coli in vitro мембраната. В този случай, в бързо растящите клетки 1 / 3 поколение време окисДНК е в половин метилирано състояние, след което е напълно метилиран. Същото е характерно за промотора за генериране на инициатор DNAA, при който метилираното полу-състояние е свързано с потискането на транскрипцията на гена. За разлика от това ремонт на новоинтезирана ДНК верига на останалата част от бактериалната хромозома се появява бързо - за 1-2 минути. Въз основа на този вид данни се предполага, че в непълнотилирано състояние гореспоменатите последователности са били екранирани от бактериални мембрани от контакти с регулаторни протеини и не могат да участват в пренасочване на започване на репликацията (период затъмнение). Мутации в ген. seqa. Времето за затъмнение е рязко намалено, което се проявява в асинхронизма на посвещенията за репликация. SEQA протеин се оказа, че е отрицателен регулатор на иницииране на репликация, работещ в етапа на взаимодействие окис с бактериални мембрани.

^ Ролята на SEQA протеин в регулация на репликацията чрез бактериални хромозоми. Ген seqa. той кодира протеин в 181 мини-киселинен остатък, чиято инактивиране е смъртоносно за бактериални клетки. Изследването на взаимодействието на този протеин с не генерирани, частично и напълно метилирани зони от началото на репликацията чрез метода на изместване на лентите по време на електрофореза в полиакриламидния гел показва предпочитаното му свързване към частично метилираните последователности. Въпреки това, за пълна (зависима от контекста) специфичност на нейното взаимодействие изисква наличието на допълнителни фактори. Всъщност, в състава на ДНК протеин комплекси, образувани с участието на частично метилирани последователности окис, протеин с молекулно тегло 24 kDa, което специфично взаимодейства с метилирана ДНК верига в окис. Скрининг клоун последователности Е. coli разрешено да клонира гена hOBH. (Свързване на хемимтилиран произход), кодиращ този протеин. Мутациите за този ген доведоха до частично загуба чрез бактериални синхронизационни клетки в инициативи за репликация, които също косвено показват участието на протеина HOBH в регулацията на започване на бактериални хромозоми в ранните етапи на клетъчния цикъл. Въпреки това, истинската роля на този протеин в репликацията все още не е известна.

Периодът на затъмнение може да приключи в резултат на постепенното завършване на метилирането на частично метилираната последователност. окисНамира се в комплекс с мембрани. Пълното метилиране на тези последователности предотвратява тяхното взаимодействие с мембраните и прави достъпни за инициатора на ДНК.

^ Прекратяване на репликацията. Срещата на две репликативни вилици в края на реплицентен цикъл на бактериалната хромозома е придружена от няколко събития, необходими за общото отделяне на двете бактериални хромозоми за клетъчното делене. Движението на репликативните вилици един към друг е придружено от хомоложна рекомбинация между дъщерните хроматиди. В случай, че броят на възникналите рекомбинации е оформен, димерът на бактериалната хромозома е оформен, докато в четен брой рекомбинации - две консервирани хромозоми. Във втория случай, отделянето на каренаните, използващи топоизомераза IV, води до пълно отделяне на дъщерни дружества на хромозоми, докато в случая на димера на бактериалната хромозома, това не е достатъчно. Разделянето на димера с образуването на мономери се осъществява в резултат на специфична за място рекомбинация в локуса dif. Под действието на резолас (специфична за място рекомбинация) XERCD.
^

4.2.2. Регидири на репликацията на плазмид Коул1

Много прокари клетъчни клетки в допълнение към основната хромозома съдържат малки екстрахромозомични DNAs, наречени плазмиди. Плазмидите, размерите, които варират от няколко хиляди до стотици хиляди двойки основания, и броя на копията на килия - от една до няколкостотин, способни на автономно (независимо от основната хромозома) репликация и стабилно наследяване на число на клетъчни поколения. Въпреки че много плазмиди дават клетки-гостоприемници с осезаеми селективни предимства (устойчивост на антибиотици, тежки метали и т.н.), повечето от тях са загадъчен. не се проявява във видимия фенотип на клетките. Тъй като тяхното съществуване е тежко натоварване върху метаболизма на клетките-гостоприемници, остава неразбираем смисъл на тяхната еволюционна стабилност. Въпреки факта, че природни условия Бактериалните клетки очевидно не изпитват налягането на избора, насочен към запазване на плазмид в клетките, последният с помощта на тънки механизми, които регулират броя на техните копия в клетките, са последователно сегрегирани между дъщерните бактериални клетки.

Област на репликация на малък плазмид Коул1, носещ резистентност гени на резистентност към колини, традиционно се използва в генетично инженерство при проектиране на векторна ДНК молекули, които се използват за клониране и експресия в клетки на Е. coli къси последователности на нуклеотиди. Ето защо е препоръчително да се вземат предвид механизмите за контролиране на репликацията на плазмид Коул1.

^ Иницииране на реплика на COLE1 плазмид. COLE1 плазмидната репликация се появява в една посока (еднопосочна репликация), използвайки репликативния апарат на клетката гостоприемник. Самият плазмид не кодира един ензим, който би трябвало да го повтори. Районът на началото на репликацията съдържа два промотора, един от тях осигурява синтеза на RNA праймер (РНК II), необходим за иницииране на плазмидна репликация. Синтезирана РНК II, чиято дължина зависи от вида на репликирания плазмид, се подлага на обработка с помощта на RNaseH за образуване на РНК с дължина 550 нуклеотида. Тази молекула се използва ефективно от ДНК полимераза I като праймер в синтеза на водещата верига на ДНК. При отсъствието на RNase H семена по време на репликацията служи 3'-края на РНК II, макар и с по-малко ефективност. В клетките дефектни на RNaseHH и ДНК полимераза, инициирането на репликацията на Коул1 се извършва чрез ДНК полимераза III с участието на РНК II съгласно описания по-горе механизъм.

И трите механизма за започване на репликацията на плазмидите се основават на уникално РНК свойство на РНК за образуване на стабилна ДНК-РНК хибрид в областта на началото на репликацията. Всъщност, обикновените транскрипти се освобождават от транскрипционния комплекс след приключването на транскрипцията и се отделянето на RNA полимераза от матрицата, което не се случва с РНК II. Анализ на плазмид мутанти, дефектни при репликация, както и обратното им, показват, че в стабилен хибрид на РНК II с матрица се осъществява взаимодействието между G-Rich RNA II контур, образуван от 265 нуклеотида над точката на иницииране на репликацията (позиция - позиция - 265) и с богата част ДНК, разположена в близост до нуклеотид -20 (фиг. I.48, но). И двете от тези последователности са консервативни в свързани плазмиди PMB1, P15A и KSF1030. Взаимодействията между посочените последователности се появяват в момента, когато РНК полимераза все още е в транскрипционния комплекс и се разбиват ДНК вериги в близост до комплекса. Равновесието между две алтернативни съответства на РНК II е от решаващо значение за определяне на дела на РНК молекулите, останали в хибрида на ДНК РНК, което е необходимо за иницииране на плазмидна репликация. Изборът между две алтернативни конформации на РНК II се определя от първичната структура на площта, разположена между нуклеотидите от -359 и -380 (последователност ) (виж фиг. I.48, \\ t б.). Тази последователност може да взаимодейства с горната допълнителна последователност  (структура ) или с хомоложна последователност , разположена под (структура ). След RNA полимераза транскрибира първите 200 нуклеотиди, получената РНК II образува временна вторична структура, за която е характерна наличието на три "стъблови вериги" (I, II и III). Удължението на РНК II все още в няколко нуклеотиди води до унищожаване на стволовия III и образуването на IV стъблото, което се стабилизира в резултат на допълнителни взаимодействия между последователностите  и . По време на последващото удължение на РНК II възниква две алтернативни възможности за формиране на вторичната им структура. Изборът в полза на дадена конформация зависи от това дали последователността на  остава свързаната с последователността  или образува нови контакти с -последователност. Преходът от допълнителни двойки  k  е придружен от силни промени в конформацията на РНК II, която в крайна сметка определя способността му да служи като грунд при репликиране на плазмиди. РНК II молекули в конформация  могат да образуват РНК-ДНК хибрид, който служи като субстрат за rnase h, и в конформация  такива способности не притежават. Предложеният модел се потвърждава преди всичко от факта, че мутациите предпочитат образуването на конформация  поради дестабилизирането на стволовия IV затруднение да функционира РНК II като грунд и да доведе до намаляване на броя на копията на плазмида на Коул1 вътре в бактериалните клетки. Такива мутантни плазмиди, дефектни при репликация, се активират в резултат на потискащи мутации стабилизиращи стволови IV. По този начин инициирането на реплика на Коул1 плазмид зависи от способността на РНК II да образува RNA-ДНК хибрид край началната точка на репликацията (ORI). В същото време образуването на хибрид се влияе от вторичната и третичната структура над съседната последователност на предшественика на праймера.

^ Фиг. I.48. Схема за регулиране на репликацията на Колела1 плазмида

но - приблизителната вторична структура на РНК II, след като транскрибира РНК полимераза  500 на лукотидите на плазмидната ДНК; По-нататъшното удължение на РНК II е придружено от образуването на ДНК-хибрид (получер стрелка) между РНК II и транскрибирана ДНК;

б. - Възможен механизъм за наблюдение на плазмидната репликация. В горната част на фигурата е изобразена генетична карта на ДНК секцията, необходима за иницииране на репликацията на плазмидна ДНК и нейното управление. Пространствените структури на две плазмидни инхибитори на репликацията са схематично представени: RNA I и ROP протеин. В долната част, две алтернативни конформации на РНК II, образувани под действието на РНК I, I-X, са елементи на вторичната структура
^ Контрол на броя на копията на плазмида Коул1. COLE1 Плазмидният репликационен контрол се извършва главно на нивото на промените в пространствената структура на РНК II. Тъй като плазмидите контролират собствения си биосинтеза, т.е. Тяхната репликация преминава върху автокатализационния механизъм, беше постулиран, че инициирането на репликацията на COLE1 е под въздействието на инхибитор, кодиран чрез плазмид, концентрацията на която в клетката е по-висока от по-големия брой вътреклетъчни копия на плазмида. Действително, анализ на механизмите на репликация на мутантни плазмиди, за които се характеризира високо копито, позволено да се идентифицират две транссъществуващи фактори, кодирани от плазмид и влияят на репликацията на плазмид in vivo.

Основният инхибитор на репликацията е малка РНК от 108 нуклеотид дълга, наречена РНК I, напълно допълващ 5'-крайната последователност на грунд грунд (РНК II). RNA генният промотор е разположен в областта на началото на репликацията на плазмидния кол1 и е насочена към обратна посока по отношение на РНК промотор II (виж фиг. I.48). Допълнителните взаимодействия между RNN I и РНК II влияят върху образуването на пространствената структура на РНК II по такъв начин, че конформацията на βγ е за предпочитане неактивна по отношение на инициирането на репликацията (виж фиг. I.48, \\ t б.долу вдясно).

Взаимодействието между РНК I и РНК II се осъществява продуктивно само докато късата РНК препис се синтезирана с не повече от 80 нуклеотида. Въпреки че взаимодействието на RNN I с такава къса последователност от нуклеотиди е по-бавно, отколкото с транскриптиране на 360 нуклеотиди, в последния случай, РНК I не влияе на конформацията на 5'-крайната част на РНК II и неговата способност да функционира като семе, когато плазмидната репликация (конформация αβ, фиг. I.48, б.долу вляво). Ясно е, че скоростта на образуване на хибриди между РНК I и РНК II се определя за ефективното функциониране на механизма за регулиране на плазмидната репликация. Процесът на взаимодействие на РНК I и РНК II в момента се изследва подробно. Тя преминава през образуването на няколко междинни продукта и е завършена чрез получаване на стабилен хибрид между напълно допълващ се една друга РНК I и 5'-крайна РНК област II.

^ RNA-организиране на протеини за ROP. Генът на втория компонент, отрицателно регулирането на репликацията на плазмида на Коул1, се картографира директно зад региона на репликация. Този ген кодира 63-връзки протеин, наречен ROP (репресор на праймер), съществуващ в разтвора под формата на димер. Както in vivo, така и in vitro ROP повишава инхибиторната активност на РНК I, без да се засяга синтеза на РНК II. В същото време ROP засяга първоначалните фази на взаимодействието на РНК I и РНК II, което улеснява прехода на много нестабилен междинен продукт с * до по-стабилен - с m *. Протеинът ROP има висок афинитет към С * и само слабо взаимодейства с изолирана РНК и РНК II in vitro. Предполага се, че ROP проявява незначителна специфичност по отношение на последователностите на нуклеотидите и разпознава някои общи функции Структурите на комплекса I-РНК II, възникнали в ранните етапи на тяхното взаимодействие. По този начин функциите на протеина за РОП изглежда се сключват при превръщането на нестабилен RNA РНК комплекс до по-стабилен, който от своя страна е придружен от потискане на образуването на праймера, необходим за започване на репликацията на плазмида на Коул1.

Използването на антисенс РНК при контрола на репликацията на бактериалния плазмид е общ прием. По-специално, репликацията на малък плазмид на ниска мощност R1 се контролира от протеина REPA, който участва в инициирането на плазмидна репликация като положителен регулаторен фактор. Синтезът на репа, от своя страна, се регулира чрез пост-транскриптор, като се използва малка антисенс Copa RNA, която е свързана с репа-иРНК в резултат на многоетапна реакция, която прилича на образуването на хибрид между РНК I и РНК II , обсъдени по-горе. Такова взаимодействие потиска генната експресия репа.може, поради разделянето на РНК-РНК-RNC-дуплекс III. Вътреклетъчната концентрация на антисенс Copa-РНК е пряко пропорционална на броя на копията на плазмида R1. Подобен механизъм е описан и за регулиране на започването на репликацията на плазмид PT181 Staphylococcus aureus.

При получаване на бактериални вектори за генетично инженерство, много от които съдържат площта на началото на репликацията на плазмидния Колел1, за да се увеличи броят на копия в бактериални клетки, често се използват инхибитори на биосинтеза на протеин, по-специално хлорамфеникол . След обсъждане на механизмите за регулиране на контрола върху реализацията на този плазмид, се основава принципите, на които се основава тази техника. Наистина, приносът към културалната среда на хлорамхиникол блокира биосинтезата на бактериалните протеини, включително протеина за РОП, който е необходим за ефективното потискане на започване на плазмидното репликация под действието на РНК I. В резултат на това копирането на Плазмидът в бактериални клетки е нарушен и те започват да бъдат непрекъснато репликирани, използвайки за тази цел, предварително синтезирани бактериални протеини.

Известно е, че два фенотипнични плазмида, използващи същия механизъм за управление на репликацията, са несъвместими в една бактериална клетка. Клетките, съдържащи два плазмида от различни групи за съвместимост, бързо се образуват от две популации в процеса на възпроизвеждане, всеки от които съдържа само един вид плазмид. Това се дължи на случайна селекция от плазмид за репликация вътре в бактериалните клетки и случайното разпределение на първоначалния пул от плазмид върху дъщерните клетки. Еволюционният външен вид на механизма за наблюдение на репликацията на бактериални плазмиди, използвайки антисенс РНК, разширява възможността за появата на плазмиди, принадлежащи към различни групи съвместимост и съжителство в същите бактериални клетки. Наистина, въпреки използването на същия механизъм, антисенс РНК, които имат различни нуклеотидни последователности, няма да могат да разпознават "хетероложни условия на РНК на други хора. Това позволява на такива плазмиди в една бактериална клетка и създава условия за по-широко разпространение в естествените популации на микроорганизми.

Лекция 3. Репликация на различна ДНК и нейното регулиране и обезщетение

Репликация в прокариот. Намаляване на ДНК (Процесът, при който информацията, кодирана в последователността на основата на молекулата на основната ДНК, се предава с максималната точност на дъщерната ДНК), изпълнява специален ензим за ДНК полимераза. Кацането Този ензим на една от ДНК нишки се предшества от строго локализирана пръстенна междина, ако ДНК е пръстен (в бактерии) и известно разделение на крайната част на неговата гигантска спирала. Отбелязваме, че ДНК полимеразата може да седи на всеки от двата края на спиралата, но задължително на конеца, че този край е 3 "конференция (независимо дали е" кодиране "или" защитна "нишка). Промоция на ензима "Матрицата" майчината нишка винаги върви в посока на 3 "-concar до 5" - съдържание. От това следва, че "допълнителният" синтезиран на тази матрица, новата ДНК нишка ще започне с нейната 5 "- конференция и увеличаване на Посока на бъдещето му 3 "- край. Тези две посоки не могат да бъдат объркани. В случай на съмнение е достатъчно да се помни, че увеличаването на новата пластина се извършва чрез постоянно присъединяване нуклеотиди Вече носеща фосфатна група, свързана с 5 "деоксирибоза-въглерод. Следователно до предишното, тя вече стои на мястото си с нуклеотид, трябва да се свърже с една група, свързана с 3" деоксирибоза-въглерод. И това означава, че разширяването на новата прежда на ДНК отива в посоката 5 "-3" . Целесъобразно е да се припомни, че работата на производството на ДНК полимераза се извършва поради енергията на химическата почивка между първия и втория фосфати на съответния нуклеосидетрифосфат - прекурсора на прикрепения нуклеотид.

Структура на репликационните точки.ДНК фрагменти, носещи точка от началото на репликацията, изолирана от Е. coli и някои плазмиди, както и от дрожди и редица еукариотни вируси. В някои случаи позицията на началото на репликацията има такава нуклеотидна последователност, че дуплексът приема необичайна конфигурация, коловоуработващите протеини разпознават протеините, участващи в инициирането. Естеството на взаимодействието между точката на започване на репликация и протеини и механизма за иницииране като цяло не се изследват.

Така че, топоизомеразата се движи по двупосочна молекула, отслабвайки водородните си връзки толкова много, че тези връзки преминат на къса терминала вече при температура от 37 ° С. След топоизомеразата, майката ДНК седи и започва да се движи по друг протеин ДНК заглавия, Кой ще трябва да играе ролята си по-късно. След това специалната РНК полимераза, работеща само от края на ДНК нишки, посочени "Прайдз"изгражда много къса рибонуклеотидна верига (наречена име "Primera") Допълване на началото на ДНК нишката. В бактериите е само 5 нуклеотида, а еукаротов е около 40. (на фиг. 28, всички праймери са показани с тънка линия, а всички ДНК нишки са мазнини.)

Втората конец на майката (дори празна) се формира заедно с първата нишка на "щепсел на Reduplication".

рибонуклеаза N.

ДНК Полимезий

Междувременно в областта на образованието третите върхове на вилицата на заснемане заключават точно същите събития, както във втория етап от намаляването. Скоростта на този процес се оценява като приблизително 1000 нуклеотида в секунда в бактерии 100 - при животни и 20 - в растения.

Много е вероятно, че в същото време подобни мутационни процеси на двойни спирали с образуването на фрагменти от предоставянето и допълнителното изграждане на нови ДНК нишки преминават от противоположния край на майчината ДНК. Разбира се, там ДНК полимеразата III непрекъснато се движи по резбата на ДНК, която наричахме 2-рад и първата нишка се нарязва на фрагменти. Когато се открият две движения, две дъщерни копия на оригиналната ДНК са готови. (Техните "спасявания" са в същото време.) По начина, по който се оказа, че дължината на фрагментите от предоставянето на Е. coli (1-2 хиляди нуклеотиди) е много по-голяма от тази на еукариотите (по-малко от 200) . Съвпадението на тази последна цифра с дължина на ДНК в нуклеозома не е лишена от интерес (виж по-долу).

По-сложен модел на движение на репликативния щепсел включва формирането на репускуването - многократен комплекс от по-високо ниво на организация. Този комплекс се състои от функционален комплекс Primo-Pryymaz, хеликоптер, полимераза III и евентуално гираза. Такъв комплекс може да елиминира водещата верига и в същото време да започне предимно РНК, както и завършването на ДНК в синтеза на изоставащата верига. Двама репутатори работят координирани в две репликационни вилци, които се движат в противоположни посоки по пръстеновидните хромозома, биха направили този модел още по-елегантен.

Репликация на пръстеновидни дуплекси. Репликацията се инициира и в началната точка на репликация (ORI).

Нарастващите вериги образуват репликативни щепсели, които се пенсионират или в две (по-горе), или в една (по-ниска) посока, в зависимост от естеството на началната точка на репликацията.

В някои ринг-генози всяка верига има своя собствена точка на възвръщаемост на репликацията (например в митохондриалната ДНК на животните). Синтезът на една верига започва в точката ori\u003e r\u003e. Когато новата верига стигне до точката ori\u003e d\u003e, започва синтеза на друга верига. Синтезът се инициира чрез образуване на грунд РНК.

Някои две верижни пръстенни хромозоми се възпроизвеждат по алтернативен начин репликация от вида на подвижните пръстени.В този случай двойно-верижната пръстенна ДНК се нарязва в специфичен ензим в уникалното място на една верига (точката на произход на подвижния пръстен) и нуклеотидите са свързани с полимераза 3 - хидроксилен пръстен, използвайки полимераза III; В същото време матрицата обслужва непокътната затворена верига. По този начин, само водещата нишка се синтезира в вилицата. Като синтетидираща верига 5-края на изходящия пръстен като една верига е изместена. В резултат на това дължината на водещата верига може да надвишава дължината на матрицата за 2-5 пъти. Този метод на репликация се използва чрез фаги M13 или FX174 (техните зрели геномези едноверижни пръстенни DNA) в късните етапи на инфекциозния процес, след инфекцията на ДНК се превръща в двуверна форма. Постоянно разделени единични ДНК вериги, образувани по време на репликацията на вида на подвижния пръстен, се нарязват при всяка репликационна точка и се затварят до образуването на зрели форми, опаковани в вирусни частици. FAG λ използва такъв метод за репликация при образуването на двуверна линейна вирусна ДНК. В този случай, матрицата на субстрата е двуверижна пръстенна ДНК, която се репликира след превръщането в ранните стадии на инфекцията на линейна вирусна ДНК в репликативна форма на пръстен.

Както и преди механизма на намалена наклон в Еукаров, тогава, въпреки че се научава по-лошо, тук цели пет полиамаразий-полиамари се намират тук и се характеризират тук, които се считат за показват с гръцки букви: α, β, γ, δ, и ε. Основният ензим, подобен на ДНК полимераза III в бактерии, е ДНК полимераза δ. ДНК полимераза α е отговорен за изграждането на праймери (от рибонуклеотиди). ДНК полимераза β - копира фрагментите на предоставянето и отговаря за ремонта на ДНК. ДНК полимераза γ води до синтеза на ДНК в митохондриите. Функцията на ДНК полимераза ε все още е неизвестна.

Разбира се, гигантската ДНК на най-високите организми започват да поемат правилно не само с краищата на молекулата, но и в различни междинни пунктове. Смята се, че дрождите на такива точки на началото на репликацията са около 300. Те ще се отделят един от друг с 40 хиляди двойки нуклеотиди. Има до 20 000 точки на принципа в човешката ДНК, разположен с интервал от 150 хиляди няколко ядлеотида. Очевидно, тези от началото на разделянето и кацането на ДНК полимераза δ сервират последователността относително слабо асоцииран АХ. Двойки. След инициирането, репликацията продължава в две посоки от всяка точка, докато репликативните вилици с две съседни репликационни точки не са решени. ДНК на пълен размер на всяка дъщерна хромозома се получава чрез свързване на по-къси независимо инициирани новопостроени вериги.

Теломери и центромери. Центъра и телемерите са най-ясно изразените морфологични структури на хромозомите (прозрачни 12). Дълго време се смята, че тяхната структура и функции са свързани с някои специфични ДНК последователности. Възможно е обаче да се идентифицират само една такава характеристика на молекулярно ниво: присъствието в областта на центромера и теломерата сателитна ДНК. Сателитна ДНК е дълги тандемни повторения, разположени в центъра на Центъра и Теломере.

Строителство Centromer.. При бозайници центромерите имат сложна дискообразна структура, наречена Kinetchor. От всяка страна на хромозомата се намира един киногог диск. По време на митоза, микросубелните фибрили на фибрилите са прикрепени директно към плътния външен слой на кинетокора, свързан с хроматинови контури. Пиячът в дрождена форма CEN-област (къси ДНК сегменти) заедно с ДНК свързващи протеини (прозрачни 13). Последователностите, разположени с една или от двете страни на CEN-регионите, могат да блокират преминаването на щепсела за репликация преди специфичния сигнал, позволяващ края на репликацията в атратерапията. В този случай броят на хромозомите няма да надвишава един върху дъщерна клетка.

Темьорски последователности. Telomers-Conners Еукуриотичната хромозома също са краищата на линейния ДНК дуплекс. Той е с телемери, че един от проблемите на репликацията е свързан: как са 5-те години на хромозомалния дуплекс, ако ДНК полимераза не инициира синтеза на нови вериги? Може би този въпрос също е решен като при репликиране на линейния дуплекс на аденовирусите или с помощта на алтернативни механизми? Наскоро получените доказателства сочат, че крайните области на еукариотните хромозоми - телемерите се възпроизвеждат чрез специален механизъм. Краищата на хромозомите на дрожди, безгръбначни, растения и гръбначни имат подобна структура: те съдържат плоски структури, в които са близо и 5-краищата на ДНК дуплекс, и много повтарящи се тандем. Около пантите в една от веригите в площта на повторението има няколко едноверижни пропуски. Наскоро Тетрахимена. Ензимът - ензим - теломераза се изолира - терминала deoxynucleotyltransferase, която свързва Replay 5-TTGGGG-3, последователно с един нуклеотид, до 3-те краища на специфичните олигонуклеотидни праймери (ttgggg)\u003e n\u003e ( Тетрахимена.) И (tgtgtgg)\u003e n\u003e (дрожди). Така, теломеразата може да изгради Telomers с родителската ДНК не се използва като матрица (Pprozhachka 20). Теломеразата е голям комплекс рибонуклеопротеин, а за проявление на ензимна активност са необходими и РНК и протеини. На фигурата е представен теломерите на хипотетичното образование. В горната част на фигурата формата е представена в края на веригата, съдържаща последователност 5- (tgggg)\u003e -3 и едноверижни паузи на противоположната верига, съдържаща последователността 5- (CCCCAA) \u003e N\u003e -3. Чрез третия край на долната верига използвайки каросемерата, те са свързани последователно, един нуклеотид, 5-ttggg -3 единици. Praimaz и ДНК полимераза се копират с 5- (ttgggg) N\u003e -3-верига с образуването на нови 5- (CCCCAA)\u003e N\u003e -3-единици. В резултат на непълно лигиране в богата на S-богата верига остават пропуски с едновериж. В третия край на 5- (TTGGGG)\u003e -3-вериги се образува цикъл, стабилизиран чрез взаимодействия между остатъците от гуанозин.

Прекратяване на репликацията.

Прекратяване и несъответствие в грубовете на звънене.Затварянето на структурата на много геномна ДНК опростява процеса на завършване на репликацията на цялата нуклеотидна последователност. Непрекъснатия растеж на водещата и изоставаща верига по пръстенната матрица неизбежно води до комбинация от 3-хидрокси и 5-фосфорни краища на една и съща верига, или в точката на начало на репликация, или - с двупосочна репликация - в. \\ T средата на пръстена (прозрачен 14). Пръстените в тези места на срещата са свързани с ДНК лигаза, докато те обикновено се оказват вдигнати по двойки и в бъдеще трябва да се случи тяхното разделяне към отделни геноми. Това се случва с тип II топоизомераза (прозрачен 15).

Прекратяване и несъответствие в линейна ДНК. С изключение на аденовирусната ДНК, където синтезните ДНК вериги се инициират от протеиновия праймер и матричната верига се копира напълно (прозрачна 16), във всички останали случаи, RNA праймер е необходим за репликация, която създава специални проблеми в края на репликация на линейна дуплексна ДНК (прозрачна 17). Факт е, че след започване на синтеза на новата верига и последващото отстраняване на РНК грунд, новата верига съдържа място в 5-тия край. Тъй като няма начини за удължаване на 5-те години на ДНК схеми, има и други методи за попълване на репликацията. Бяха предложени два начина.

Първо: Предполага се, че има ДНК вериги с прави обратни реверси (прозрачни 18). След репликацията, двете допълващи се краища на двата незавършени дуплекса могат да бъдат осветени и образуват линейни композитори с едноверижни пропуски. Подходящи пространства могат да бъдат запълнени чрез удължаване на веригите в посоката 3 → 5, последвано от връзката на тяхната ДНК лигаза или чрез Директно свързване на свързаните краища с помощта на ДНК лигаза с образуването на едновременни. След готвенето на концентамата, специфичното ендонуклеаз се образува чрез изпъкнали 5-краища, а ДНК полимеразата може да увеличи по-късите вериги от 3-ти.

Второ.Той приема присъствието в края на всяка ДНК верига от къси обърнати повтарящи се повторения, благодарение на които са оформени малки примки (прозрачни 19). 3-краен цикъл служи като праймер за копиране на неплатена зона. Поради специфичното разкъсване в началото на обърнатата повторение се получава структура, която може да бъде завършена от 3-то място за възстановяване на началната двуверкова крайна последователност.

Също така отбелязваме, че всички ДНК полимерази водещи допълнителен синтез, както в бактерии, така и в EUKARYOT, също имат изконна активност в посока 3 "-5", в обратна посока на синтеза. Те могат да се включат "и да премахнат прикрепения нуклеотид като него. Това е много важен механизъм за премахване на грешките в допълнителен синтез. В крайна сметка е възможно да се открие грешка, когато вече е направена. И веднага го поправете! Той "знае как да се прави ДНК полимераза. Такава корекция не е необичайна, а скоростта. Смята се, че без него, с намаляването на ДНК от Е. coli, 5-10% от нуклеотидите биха били засегнати неправилно. Благодарение на корекцията на 1, грешка в тази ДНК представлява десет милиона базови двойки.

ДНК репарация

ДНК е единствената макромолекула на клетка, която може да елиминира (погаси) щетите, възникнали в неговата структура. Освен това е кодирана информация за механизмите на голямо разнообразие от процеси на обезщетения. Безплатно сдвояване в основата на репликацията на ДНК, но и процесът на възстановяване на оригиналната ДНК структура по време на повреда, засягаща молекулата, модификации на една или друга база или погрешно сдвояване по време на рекомбинацията (виж по-долу). Едновременното увреждане на двете вериги на едно място и двойно-верижните пропуски често са фатални за ДНК, тъй като такива дефекти се поемат само в редки случаи.

Най-често разкъсването на гликозидични връзки между пурин и деоксирибоза n (депуратификация) с нарастваща температура. През деня в клетката на дадено лице е направено от 5000 до 10 000 акта на деклариране - води до нарушаване на репликацията и изразяването на гени. В допълнение, остатъците от С и А могат да бъдат подложени на спонтанен дезант с образуването на съответно остатъци от Y и хипоксантин; Честотата на такива събития е приблизително 100 върху генома - води до появата на мутации.

Много промени в структурата на ДНК се появяват под влиянието на химикали, присъстващи в околната среда. Това са алкилиращи средства (азотни съединения, алкилсулфонати, нитрозук), които са за предпочитане за г-н остатъци, съединения, които са вградени между съседни базови двойки и водят до появата на вмъкване и делеции по време на репликацията; Бифункционални агенти, способни да образуват ковалентни залози между две ДНК вериги и да блокират несъответствието си при репликация. Не по-малко озвучетелни физически ефекти - абсорбцията на t или c UV светлина води до образуването на циклобутанови димери между съседните пиримидианци; йонизиращото радиация (космически лъчи) допринася за образуването на високо абсорбиращи се свободни радикали, които имат при изключени различни въздействия; Рентгеновите лъчи са причинени в ДНК единични и дву верижни пропуски, както и други характеристики на увреждане на ефектите на свободните радикали.

Известни са два основни метода за репарационни процеси:

директна корекция на модификации или неправилно сдвояване, без да се изисква репликация за възстановяване на първоначалната структура;

премахване на нуклеотиди около неправилно сдвоени или модифицирани базови двойки и пребиваване на тази област чрез репликация.

обезщетение чрез директно възстановяване на първоначалната структура.

Ако се под въздействието на алкилиращи средства - N-метил-N-нитрозога и N1, N-диметилнитозогуанидин, ДНК образува на 6 - метил или около 6-алкил-заместени гуанинови остатъци, след това скандацията на такива остатъци идва с участието на ензими - около 6-метилгуанин -DNK-алкилтрансфераза, която катализира трансфера на алкилови групи в сутинни групи цистеинови остатъци на ензима, докато акцепторният протеин е инактивиран. Тя е в бактерии и бозайници.

Ако се образуват циклобутанови димери между съседните двойки пиримидинови бази по време на радиацията на ДНК на UV светлината, тя е ензимна (фото-бозайници) трансформация в мономери, когато разтворът е видим в дължината на вълната от 300-600 nm. Ензимът образува стабилен комплекс с пиримидинов димер и използването на енергийната абсорбция към тях унищожава димера, без да нарушават ДНК веригите.

Обезщетение чрез замяна на модифицирани остатъци.

Замяната на модифицирания нуклеотид обикновено се извършва на четири етапа:

Етап 1. Ензимът разпознава този нуклеотид и намалява полинуклеотидната верига в близост до нея или прекъсва гликозидната връзка между модифицираната база и дезоксирибозата. Възстановяването на местата, при което възникнало дело или депурмидилизация се извършва от ензимите на AR (Apurinovy, апаримидин) -enendonucleases. При репарации на N-алкилирани пурини и други модифицирани основи, ензимите се възпроизвеждат от N-гликозилаза, разделяйки гликозидната връзка между модифицираната база и дезозоцирбозата (прозрачна 25)

2 етап. Изключителността премахва модифицираните нуклеотидни и / или съседни нуклеотиди, оставяйки малък начин.

3 етапа. Отдалеченото място се синтезира отново от 3-накрайник, използвайки противоположната верига като матрица.

4 етапа. Краищата на пролуката, образувана в резултат на ремонта, са свързани с възстановяването на ковалентната цялост на веригата на препредаването (прозрачен 26)

Стойност на репарацията на ДНК.

Репликационните грешки са важни, тъй като повечето от щетите блокират прехвърлянето на генетична информация на последващото поколение, а останалите, ако не са елиминирани, поддържани в генома на потомците и водят до драматични промени в протеиновите молекули, ензимите, необходими за поддържат жизнените клетки на клетката. В случай на повреда на определени единици, клетките на клетките стават особено уязвими към някои химически и физически агенти. Хората, страдащи от, например, пигмент Kservoch, са много чувствителни към UV светлина и развиват различни форми на рак на кожата дори с много слаба експозиция. слънчева светлина. Клетките на такива хора носят мутация в Rad-гени, които се проявяват във факта, че са абсорбили способността да се изтласкват пиримидинови димери от UV-облъчена ДНК. Заболяването може да се дължи на мунусия в един от най-малко девет гена, който показва доста сложен механизъм за репарация на ДНК, съдържаща тиминични димери, при хора. Като правило заболяването е свързано с невъзможността за разбиване на тиминови димери. Ако обвитките клетки в културата се добавят ензим, имащ тимидимгликозилаза и Ar-ендонуклеза, тогава UV щетите могат да бъдат премахнати.