Пилешки ембрион Пилешки ембрион
(CE) - пилешки ембрион на различни етапи от ембрионалното развитие. В микробиол. практика се използва за изолиране, култивиране и идентифициране на вируси, рикетсия и понякога бактерии. За лабораторни цели изберете пресни, оплодени, с добре полупрозрачна и без пукнатини EC обвивка. Инкубацията се извършва в гнездата на статива с тъп край на яйцето нагоре в добре проветриви инкубатори или термостати при 37 -37,5 ° C, относителна влажност 63-65%. За инфекция се избират 4-13-дневни ембриони с изразени кръвоносни съдове, жълтъчна торбичка и подвижна сянка. Преди заразяване, черупките на яйцата се третират с алкохол, изгарят се и в зоната за инжектиране (обикновено над въздушната камера) се смазват с 2% йодна тинктура. Материал или изследване to-ru се въвежда, отваряйки или без отваряне на черупката, в жълтъчната торбичка (рикетсия), в алантоисната или амниотичната кухина (повечето вируси), нанесена върху хорион-алантоисната мембрана. По-рядко to-py се инжектира в тялото на ембриона или интравенозно. Заразените СЕ се поставят в термостат при условия и за периоди, които зависят от вида на микробите и целите на изследването. Някои данни за резултатите от инфекцията могат да бъдат получени чрез външно изследване на СЕ под микроскоп (съдова инжекция, загуба на подвижност и др.). В повечето случаи обаче CE се отваря. За да се направи това, след лечение с алкохол и йодна тинктура, черупката се отрязва над границата на въздушната възглавница, с пипета или спринцовка на Пастьор, първо се аспирира алантоисна и след това околоплодна течност, като се избягва увреждане на съдовете и жълтъчната торбичка . Ембрионът и хорионлантоисната мембрана се отстраняват от черупката, поставят се в стерилни съдове, измиват се със стерилна дестилирана вода. вода и прегледайте. По-нататъшният ход на изследването на ембриона и неговите течности зависи от вида на микроба или вируса и целите на експеримента.
(Източник: Речник на термините за микробиология)
Вижте какво е „Пилешки ембрион“ в други речници:
ЕМБРИОТОКСИЧНОСТ- ембриотоксичност, способността на физически, биологични, химични и други агенти да имат отрицателен ефект върху развиващия се ембрион. Ембриотоксичният ефект на различни вещества се установява чрез излагането им на жени ... ... Ветеринарен енциклопедичен речник
Искането на пилета се пренасочва тук; вижте и други значения. ? Домашно пиле ... Уикипедия
Пилета Пилетата са украса на всеки двор Научна класификация Кралство: Животни Тип: Хордати Клас ... Уикипедия
Изолиране на вируси в лабораторни животни.
Изборът на лабораторни животни зависи от вида на вируса. Лабораторните животни са биологичен модел. Понякога е необходимо да се извършат 3-5 „слепи“, асимптоматични пасажи, преди вирусът да може да бъде адаптиран към лабораторните условия. Лабораторните животни обаче не са податливи на някои вируси; в този случай трябва да се използват естествено податливи животни. Както например при чума по свинете и инфекциозна анемия на конете.
Цел на заразяване на лабораторни животни:
1. Да се изследва патогенезата на заболяването;
2. Изолирайте вируса от pat.material;
3. Производство на имунни и хиперимунни серуми;
4. Производство на ваксини;
5. Поддържане на вируси в лабораторни условия;
6. Титруване, за да се определи количеството на вируса в единица обем;
7. Биологичен модел за определяне на реакцията на неутрализация;
Изборът на метод за заразяване на лабораторни животни зависи от тропизма на вируса. По този начин, по време на култивирането на невротропни вируси, животните се заразяват в мозъка; дихателна интранозално, интратрахеално; дерматропен - подкожно и интрадермално.
Заразяването се извършва в съответствие с правилата на асептиката и антисептиците.
Има много начини за въвеждане на ваксиниран материал в тялото на животните:
Подкожно; - Вътремозъчна; - Интрадермално;
Интраперитонеално; - Интрамускулно; - Вътреочно;
Интравенозно; - Интранозално; - Хранителни;
След заразяване животните се етикетират, поставят се в изолирана кутия и се наблюдават в продължение на 10 дни. Смъртта на животно през първия ден след инфекцията се счита за неспецифична и не се взема предвид в бъдеще.
3 признака показват ефективността на инфекцията:
Наличието на клинични признаци
Смърт на животно
Патологични промени (размер, форма, цвят и консистенция на органа).
Пилешки ембриони се оплождат яйцев които се развива ембрионът (ембрионът). Култивирането на вируси върху ембриони от пилета и пъдпъдъци наскоро стана широко разпространено като един от най-простите и надеждни методи за култивиране и диагностика на много вируси и някои бактерии - бруцела, рикетсия, вибриони.
Много човешки и животински вируси могат да бъдат култивирани в развитието на пилешки ембриони. Ембрионалната тъкан, особено ембрионалната мембрана, богата на тъкани на ембрионалния епител, е благоприятна среда за размножаването на много вируси. Вирусите с епителни свойства (едра шарка, ILT и др.) Успешно се развиват върху хорионлантоисната мембрана, причинявайки макроскопски видими промени. Различни представители на миксовируси (грип, нюкасълска болест, чума на месоядни животни и др.), Вируси на инфекциозен бронхит, хепатит на патета, арбовируси и др. Се размножават добре в ембриона, когато материалът се инжектира в алантоисната кухина. Някои вируси се култивират успешно в жълтъчната торбичка.
Ползи:
1. Икономически ефективни, освен това яйцата са лесно достъпни;
2. Развиващите се пилешки ембриони нямат защитни механизми, тъй като имунната система все още не е развита;
3. Черупката на яйцата предотвратява проникването на бактерии и вируси през нея. околната среда;
За отглеждането и изолирането на вируси в пилешки ембриони е необходимо много просто оборудване - обикновен термостат или инкубатор.
Условия:
1. Яйцата се получават от ферми, за които е известно, че са безопасни инфекциозни заболявания;
2. Пилешките ембриони се получават най-добре от бели породи пилета (Leghorn, Russian White), тъй като те са по-устойчиви на манипулация и не умират от малки наранявания. Освен това черупката им е бяла и по-прозрачна от тази на другите породи и е по-лесна за проглеждане, което е удобно за гледане и наблюдение по време на работа с тях;
3. За инкубация изберете оплодени яйца, снети преди не повече от 10 дни;
4. Вземат незамърсени яйца, тъй като не могат да бъдат измити преди инкубацията, а мръсните яйца са по-зловещи, когато се гледат (овоскопия) и при работа с тях ембрионът може да бъде заразен по време на манипулация;
Яйцата се инкубират в инкубатор или в термостат с нагряване на вода и достъп на въздух, а по време на инкубацията в термостат, яйцата трябва да се обръщат 2-3 пъти на ден и за по-добър обмен на газ те трябва да се вадят за 5-10 минути във въздуха. За да се поддържа определена влажност, в термостата се поставя съд с вода за изпаряване; температурата в термостата трябва да бъде 38 °.
Развитието на ембриона се случва още в първия ден на инкубацията, извършва се полагането на мозъка и скелета. Структурата на пилешки ембрион на възраст 7-9 дни(виж тетрадката).
За инфекция най-често се използват ембриони на възраст 7-12 дни. Работата с пилешки ембриони се извършва в стерилна боксова стая с най-стриктно спазване на асептиката.
Цел на заразяване с пилешки ембриони:
1. Изберете реда от pat.material;
2. Производство на ваксини;
3. Поддържане на вируса в лабораторни условия;
4. Титруване на вируси;
5. Биологичен модел за определяне на реакцията на неутрализация;
6. Изследване на интерференцията на вирусите и производството на интерферон; Инфекция на пилешки ембриони:
За инфекция е необходимо да се изберат жизнеспособни ембриони с добре дефинирана подвижност. Преди заразяване всички ембриони се изследват внимателно в затъмнена стая на овоскоп.
По време на трансилуминацията на ембрионите преди инфекцията върху нея се изчертават пугу (въздушна кухина), ходът на големите кръвоносни съдове и мястото на представяне на ембриона, т.е. областта на черупката, където ембрионът лежи най-близо до него черупка с обикновен молив. След това марката на пугата, мястото на представяне на ембриона и хода на големите кръвоносни съдове служат като ориентир при избора на мястото на инжектиране на ваксиниран материал по време на инфекцията.
Избраните за инфекция пилешки ембриони се прехвърлят в кутия, където работят с тях. Преди заразяване, черупката на мястото на въвеждане на материала се обработва два пъти с йодиран алкохол и се изстрелва. Дозата на инфекцията е 0,1-0,2 cm.
В зависимост от вида на вируса и целта на инфекцията има различни методи за въвеждане на ваксиниран материал:
1) Инфекция с хорионлантоисна мембрана , ембриони на възраст 7-12 дни се използват за изолиране и култивиране на невротропни, дерматропни и някои пантропни вируси (едра шарка, енцефаломиелит, ILT, шап, бяс, чума и др.). Има 3 вида инфекция:
а) отворете чушката и я отрежете с ножици, отделете мембраната на черупката и нанесете материал върху хорионлантоисната мембрана (HAO). След това дупката в яйцето се запечатва със стерилна стъклена капачка и ръбовете на капачката се вощи;
б) изрежете с пила (пила) или назъбен скалпел в черупката триъгълник с дължина на страната около 1 см на границата на пугата от страната на представянето на ембриона, отстранете част от черупката под-черупка с пинсета и инжектирайте материала. Отворът се затваря със стерилно стъклено покритие, а краищата се вощират или запечатват със стерилна самозалепваща лента.
в) малка площ от черупката с площ около 0,5 cm се отстранява със скалпел на мястото на представяне на ембриона, след което мембраната на под-черупката се отстранява в тази област с пинсета или игла и материалът се инжектира. Ако материалът не се побира добре в кухината на яйцето, можете да използвате гумена крушка за изпомпване на въздуха от пого през отвора в черупката на мопса и в резултат на това се образува изкуствен мопс на място на въвеждане на материала и след това материалът се въвежда лесно. Дупката в черупката се затваря с лепяща мазилка или се вощи.
2) Инфекция в алантоисната кухина. Този метод на заразяване е много прост и се използва за изолиране на много вируси. За инфекция се вземат 10-11-дневни ембриони. Има два вида инфекция:
а) заразяването се осъществява през мопса, без да се отрязва. С игла измерете разстоянието от горната част на мопса до границата на мопса, маркирано с молив върху черупката, и вкарайте иглата до маркираната дълбочина и задълбочете още 0,5 см, за да пробиете хорионлантоисната мембрана;
б) материалът се инжектира с игла чрез пункция в черупката на мястото на представяне на ембриона на дълбочина 3-5 mm в аваскуларната област. Дупката в черупката се затваря с лепяща мазилка или се вощи.
3) Инфекция в жълтъчната торбичка. За инфекция се използват 5-8-дневни ембриони. Има два вида инфекция:
а) иглата се вкарва от страната на мопса в жълтъчната торбичка под ъгъл 45 ° спрямо мястото на представяне на ембриона под контрола на овоскоп;
б) яйцето се поставя върху опора с предлежанието на ембриона надолу и иглата се вкарва отгоре надолу към ембриона на дълбочина около 1 cm.
Мястото на инжектиране се запечатва с лепилна мазилка и се нанася с восък. четири) Инфекция в околоплодната кухина.При този метод на заразяване вирусът може да проникне в различни клетки, които са в контакт с околоплодната течност и да се размножава в тях. за удобство на инфекцията се препоръчва да се инкубират ембрионите с уплаха нагоре 2-3 дни преди заразяването. Тогава ембрионът и амнионът се движат нагоре и е по-удобно да се заразят. Има два вида инфекция:
а) чушката се отваря и отрязва, мембраната на черупката се отстранява с пинсета и амнионът се улавя, амнионът се изтегля с пинсета и материалът се инжектира в амниотичната кухина в доза 0,1 ml. След това отворът на черупката се запечатва със стерилна стъклена капачка и ръбовете се вощи;
б) инфекция с дълга игла през мопс в тъмна стая под контрола на окото.Иглата първо се огъва под прав ъгъл, за да се образува малка площ. Иглата се вкарва под контрола на окото през мопса на пре-ембриона, под натиска на тъпата игла ембрионът ще се движи в този случай, след което амнионът се пробива с леко натискане и иглата леко се изтегля обратно. В този случай ембрионът трябва да се движи нагоре зад иглата. След това се въвежда материалът.
5) Инфекция в тялото на ембриона и инфекция в мозъка. Използват се 7-12-дневни ембриони, заразяването се извършва чрез въвеждане на материала в различни части на тялото или директно в мозъка. За инфекция мопсът се отваря и ембрионът се изтегля с пинсета. При тези методи на заразяване смъртта на ембриони от нараняване може да бъде до 30% или повече от броя на заразените.
6) Инфекция в големи кръвоносни съдове на хорионлантоисната мембрана. Този метод на заразяване, подобно на предишния, се използва много рядко. Материалът се инжектира с тънка игла след отстраняване на черупката по протежение на кръвоносния съд директно в съда по протежение на кръвния поток.
След заразяване пилешките ембриони трябва да бъдат маркирани с обикновен молив и поставени в термостат. Те се наблюдават ежедневно чрез преглед, наблюдението се извършва до 7-8 дни, в зависимост от вида на вируса. В случай на смърт на ембриони, те спешно се изваждат от термостата и се поставят в хладилника до отваряне. Ако ембрионът е умрял през първите 14-18 часа, това може да е от травма или токсичност на патологичния материал. Следователно, както в случай на инфекция на лабораторни животни, при съмнителни случаи се препоръчва да се направят няколко пасажа и да се вземат няколко ембриони за всеки материал по време на експеримента.
Аутопсията на мъртви заразени пилешки ембриони или тези, отстранени след периода на наблюдение, се извършва при спазване на всички правила за асептика при стерилни боксови условия. При отваряне черупката се третира с алкохол и се изстрелва, след което чумата се отрязва. В отворения ембрион първо се изсмуква алантоисната течност (нейното количество е около 7 ml), след това околоплодната мембрана се изтегля назад с пинсета, пробива се с пипета на Пастьор и се изсмуква околоплодната течност (нейното количество е 1,0-1,5 ml), след това се събира жълтъкът, мембраните се отстраняват и зародиш. Течността, мембраните и самият ембрион се изследват внимателно за промени. Околоплодните води обикновено са напълно прозрачни; при заразяване могат да бъдат мътни, кървави. Характерните промени, причинени от вируса, са най-силно изразени върху хорионлантоисната мембрана: появяват се възпалителни огнища, непрозрачни, кръгли и кръвоизливи. Кръвоизливите могат да бъдат върху тялото на ембриона. Целият материал се събира в стерилен контейнер.
Пилешките ембриони във вирусологията се използват широко не само за изолиране на вируси, но и за натрупване и производство на антигени, за приготвяне на живи и убити ваксини, титруване на вируси, за организиране на реакция на неутрализация на вируса, за отслабване (отслабване) вируси, за изследване на намесата на вируси и получаване на интерферон ...
Пилешките ембриони са много евтина и удобна система за култивиране на грипни вируси. Почти всички щамове вируси от човешки и животински произход се размножават в ембриони в една или друга степен. Лабораторните щамове, които са най-добре адаптирани към тази система, дават достатъчно високи титри в ембрионите или 10-10 pfu на ембрион). Освен това ембрионът е изолиран от външната среда и следователно вирусът няма нужда да се размножава в него. създайтеспециални стерилни условия.
Вирусът обикновено се инжектира в напълнената с течност алантоисна кухина на яйцето, откъдето може да проникне в хорионлантоисната мембрана и да зарази клетките, които го образуват. Вирусното потомство излиза в алантоисната течност и може лесно да бъде отстранено от яйцеклетката чрез аспирация на тази течност. Някои щамове впо-специално нови естествени изолати, както и вируси от този тип ОТразмножават се слабо върху хорио-калантоисната мембрана, но се размножават, когато се инжектират директно в околоплодната кухина; вирусът получава достъп до различни тъкани на ембриона и полученото потомство се освобождава в околоплодните води, което може да се отстрани отделно.
Вирусът се размножава най-добре в 10 до 12-дневни ембриони. Прясно оплодените яйца трябва да бъдат закупени и инкубирани при необходимост в лабораторията. Не е необходимо да имате специално оборудване за това, но инкубаторът е много удобен. Яйцата обаче могат успешно да се инкубират в конвенционален инкубатор във влажна атмосфера при 37 ° C, ако редовно се обръщат. Класът на яйцата няма от особено значение, но в някои случаи е важно да се изключи възможността за замърсяване на яйцето с други микроорганизми; някои продавачи продават специални незамърсени яйца.
Уверете се, че яйцата са действително оплодени преди инфекция. За да направите това, просто погледнете яйцето в близост до източник на ярка светлина в тъмна стая. 4-5 дни след оплождането ембрионът трябва да бъде ясно видим.
При стандартното преминаване на лабораторни щамове вирусният инокулум обикновено представлява проба от заразена алантоисна или културална течност. По правило пробите се разреждат с физиологичен разтвор на Hanks до концентрация на вирус 10-10 pfu / ml преди употреба, тъй като въвеждането на голямо количество вирус в яйцето допринася за образуването на HDV. Ако разреденият вирус трябва да се съхранява преди инфекцията, желатинът трябва да се добави към разтвора за разреждане. Естествено е необходимо да се гарантира стерилността на вируса, използван за инфекция; в случаите, когато това е трудно, към инокулума се добавя антибиотикът гентамицин.
Тези методи включват използване на хомогенизиране за смилане на проби, нискоскоростно центрофугиране за избистрянето им и въвеждане на неразреден супернатант в амниотичната кухина.
Инфекция на ембриони.
I. Въвеждане на вируса в алантоисната кухина
- 1. Яйцата се слагат отстрани и се втриват отгоре с алкохол до стерилизациязона около точката на заразяване.
- 2. В черупката се прави малък отвор с помощта на зъбна бормашина, снабдена с режещ диск. Дупката трябва да е достатъчно дълбока, за да позволи поставянето на иглата заинжектиране, но е препоръчително да не се повреди вътрешната мембрана на черупката.
- 3. С помощта на спринцовка с игла № 25, 0,1 ml от вируса се инокулира в алантоисната кухина, докато иглата се поставя директно под черупката.
- 4. Дупката в черупката е запечатана с малко количество разтопен восък.
- 5. Заразените яйца се инкубират в термостат във влажна атмосфера с острия край надолу. По време на инкубацията няма нужда да се обръщат яйцата.
II. Въвеждане на вируса в амниотичната кухина
- 1. Тъпият край на яйцето се стерилизира чрез триене с алкохол и се прави малка дупка, както е показано на диаграмата.
- 2. Яйцето се поставя близо до източник на ярка светлина в тъмна стая, така че ембрионът да се вижда.
- 3. В направената дупка се вкарва игла No 23 с дължина 4 см и след това с рязко движение по посока на ембриона в амниотичната кухина. В същото време се въвеждат 0,1 ml от вируса и иглата се отстранява внимателно.
- 4. Дупката в черупката се запечатва с разтопен восък и яйцата се инкубират, както по-горе.
Време за инкубация.
Оптималното време на инкубация, необходимо за получаване на максимален добив от вируса, зависи от конкретния щам и трябва да бъде определено експериментално. За някои щамове на грипен вирус А, като вирус на чума по птиците, максималният добив се достига след 24-26 часа, докато повечето щамове на човешкия грипен вирус А, както и вирусите от тип В и ОТизискват 48-72 часа инкубация.
Събиране на вируса.
Преди да се опитате да извлечете ваксинирана течност от яйцето, препоръчително е да охладите яйцето за 4-18 часа при 4 ° C или за 30 минути при -20 ° C. При охлаждане ембрионът умира и околните кръвоносни съдове се стесняват. По този начин възможността за замърсяване на ваксинираната течност с еритроцити, които могат да свържат част от вируса и по този начин да намалят продукцията му, е значително намалена. Ако замърсяването с еритроцити все още не може да бъде избегнато, загубата на вируса може да бъде сведена до минимум чрез инкубиране на материала за 30 минути при 37 ° C. При тези условия вирион невраминидазата унищожава еритроцитните рецептори, с които се свързва вирусът, и той се освобождава.
I. Събиране на алантоисна течност
- 1. Яйцата се поставят на стойка с тъп край нагоре и повърхността се стерилизира с алкохол.
- 2. Тъпият край на яйцето се отваря с помощта на стерилни форцепс или специално устройство. Черупката около въздушната торбичка се отстранява, излагайки алантоисната кухина.
- 3. С помощта на стерилни тъпи форцепси разкъсайте хорионлантоисната мембрана и я натиснете до ръба на яйцето.
- 4. Ембрионът и жълтъчната торбичка се изтласкват внимателно с пинсета и алантоисната течност се аспирира с пипета с широк край. От средно голямо яйце се получават 7-10 ml бледожълта течност. Смес от жълтък в алантоената течност пречи на по-нататъшното пречистване на вируса, следователно, когато той селекцияувреждането на жълтъчната торбичка трябва да се избягва. Ако вирусът е предназначен за биохимични изследвания, например, за анализ на активността на вирион ензимите, алантоисната течност трябва да се събира при 0 ° С.
- 5. Алантоевата течност се избистря чрез центрофугиране за 10 минути при 10 000 ж и супернатантата се съхранява при 4 или -70 ° С.
II. Събиране на околоплодна течност
- 1. Повърхността на яйцето се стерилизира и тъпият край се отваря, както е описано по-горе. Отстранете колкото се може повече от черупката, за да може лесно да се отстрани съдържанието на яйцето.
- 2. Хорионлантоисната мембрана се разкъсва и съдържанието на яйцето се изсипва в стерилен съд на Петри. В този случай околоплодната кухина трябва да остане непокътната.
- 3. ОТС помощта на спринцовка с игла № 25 съдържанието се извлича от амниотичната кухина възможно най-пълно.
- 4. Амниотичната течност се избистря и съхранява по същия начин като алантоисната течност.
Очаквана продукция.
Интензивността на размножаването на вируса в ембрионите зависи от конкретния щам. Дивите щамове първоначално дават много ниски титри, но след няколко пасажи в ембриони титърът се увеличава значително. За различните лабораторни щамове, адаптирани за размножаване върху ембриони, добивът също варира значително, но в повечето случаи 2000-5000, а понякога и до 20 000 HAU / ml вирус се натрупват в алантоисната течност. Очевидно е, че адаптацията към репродукцията при ембрионите е свързана отизбор на генетични варианти, така че трябва да имате вс оглед на факта, че резултатите от подробно генетично и биохимично изследване на щамове, преминали върху ембриони, не характеризират непременно първоначалния изолат.
Цел на урока
Да запознае студентите с методите за подбор на пилешки ембриони за отглеждане на вируси.
Оборудване и материали
Пилешки ембриони на възраст 9-12 дни за инкубация, овоскоп, тампони с алкохол, стойки за ембриони, пинсети, ножици, лепяща мазилка, игли, спринцовки, моливи, удари, игли, таблици, схеми, мултимедийно оборудване, презентации MS Office Power Pointпо темата на урока.
Методика за провеждане на урока и насокипо тази тема
Обяснение на учителя
Култивирането на вируси върху пилешки ембриони е най-достъпният и удобен метод за първично изолиране на вируса. Практиката за използване на този метод на заразяване показва редица предимства пред другите методи. За инфекция се използват ембриони от 5-12 дни инкубация.
ПРЕДИМСТВА И НЕДОСТАТЪЦИ НА ПИЛЕЩИ ЕМБРИОЗИ КАТО БИОЛОГИЧНИ ОБЕКТИ
Култивирането на вируси в пилешки ембриони е най-достъпният и удобен метод както за първично изолиране на вируси от болни животни и от обекти на околната среда, така и за последващо култивиране на вируси в лаборатория. Този метод се използва широко за идентифициране на вируси и антитела, както и за приготвяне на ваксини и диагностика. Приложната практика показва редица предимства на този метод пред отглеждането на вируси в лабораторни животни. Известно е, че белите мишки, които са широко използвани при вирусологични изследвания, могат да бъдат спонтанно заразени с редица вирусни инфекции: ектомелия, лимфоцитен хориоменингит, енцефалит на Тейлър, вирусна пневмония, вирус Sendai и други, което изключително усложнява работата и често води до погрешни изводи при оценяване на получените резултати. Култивирането на вируси върху пилешки ембриони до голяма степен премахва горепосочените трудности. Заедно с това, от пилешки ембрион, можете да получите значително голямо количествовирус, отколкото от лабораторни животни. Пилешкият ембрион има по-голяма жизнеспособност и устойчивост на всякакви влияния, които са неизбежни при въвеждането на тестовия материал. С познатото умение за работа с ембриони и спазване на правилата на асептиката, смъртта им е незначителна. Най-голямата загуба на ембриони възниква, когато материалът се въведе в околоплодната кухина и жълтъчната торбичка, но дори в тези случаи тя не надвишава 10-15%, ако са изпълнени необходимите условия за инкубация.
Пилешките ембриони като жива система навлизат във вирусологичната практика през 30-те години на XX век. Използването им разшири гамата от вируси, култивирани в лабораторни условия, направи възможно по-успешно решаване на проблемите, изправени пред вирусологията, поради факта, че пилешките ембриони имат редица предимства пред лабораторните животни: 1) черупката и мембраната на черупката надеждно защитават ембрион от бактериална инфекция от външната среда; 2) важно предимство на ембрионите е тяхната висока чувствителност към широк спектър от вируси, което се обяснява с недостатъчното развитие на защитните механизми; 3) пилешките ембриони са лесно достъпен обект поради развитието на широка мрежа от птицеферми и люпилни; 4) пилешките ембриони са икономични, не изискват грижи и хранене.
Основните недостатъци са: 1) невъзможността да се гарантира напълно стерилността на тази жива система, тъй като ембрионите могат да носят вируси и други патогенни агенти в тяхното съдържание (вируси на инфекциозен бронхит на пилета, нюкасълска болест, грип, левкемия, хламидия и микоплазма) . Тяхното присъствие може да изкриви резултатите от изследването; 2) пилешките ембриони не са чувствителни към всички вируси.
ЦЕЛИ НА ИЗПОЛЗВАНЕТО НА ПИЛЕЩИ ЕМБРИОСИ
Пилешките ембриони се използват във вирусологията предимно за същите цели като лабораторните животни, а именно:
- откриване на активен вирус в патологичен материал чрез биоанализ;
- първично изолиране на вируса. Вирусите, които причиняват болести при птиците, както и някои вируси на бозайници се изолират ефективно и се култивират върху пилешки ембриони;
- поддържане на вируси в лабораторията;
- титруване на вируси;
- натрупване на вируса за лабораторни изследванияи получаване на ваксини;
- като тестов обект в реакцията на неутрализация.
ИЗИСКВАНИЯ ЗА ПИЛЕТО ЕМБРИО
Яйцата трябва да се получават от безопасна храна вирусни заболяванияферми. В оплодените яйца, дори от клинично здрави пилета, могат да бъдат открити различни вируси при тези птици: нюкасълска болест, инфекциозен бронхит, инфекциозен ларинготрахеит, енцефаломиелит, парагрип-2, полиартрит, едра шарка, арбовируси, аденовируси и др. Наличието на тези вируси може, от една страна, да доведе до диагностични грешки, а от друга, въз основа на явлението интерференция, до потискане на размножаването на вируса в тестовата проба. Ембрионите, които не съдържат вируса, но са получени от пилета, асимптоматично заразени с определени вируси, също могат да бъдат по-малко чувствителни или напълно нечувствителни към действието на този вирус поради наличието на специфични антитела, получени от майката с жълтъка. За успешното изолиране на вируса е необходимо пилетата, чиито ембриони се използват в работа, да не бъдат ваксинирани срещу болестта, причинителят на която се търси. Черупката на яйцата трябва да е непигментирана, чиста (не можете да измивате). Възрастта на ембриона трябва да съответства на избрания метод на заразяване.
За да се осигури нормалното развитие на ембрионите в оплодените яйца, трябва да се спазват определена температура и влажност по време на инкубационния период. Развиващите се ембриони понасят прегряването много по-зле от охлаждането. Следователно, краткосрочната (в рамките на няколко часа) повреда в отоплителната система не носи голяма вреда. За по-дълги почивки се изисква отопление.
Инкубираните яйца се нуждаят от свободен достъп свеж въздухкойто влиза през отвори. Те винаги трябва да са отворени. Както обикновено се смята, едно яйце консумира 1 литър кислород на ден, което не е изненадващо, ако си спомните бързото развитие на ембриона по време на 21 дни инкубация. Ето защо яйцата не могат да се поставят едно до друго, както и едно върху друго. Конвенционалните термостати не са подходящи за инкубация на яйца. Само в случай на крайна необходимост те могат да бъдат използвани за тези цели, но в същото време често проветрявайте и поставяйте съд с вода вътре, за да осигурите необходимата влажност.
Яйцата, поставени за инкубация, се осветяват за 3-5 дни, като се използва специална маса или ръчна лампа (ако яйцата не се изваждат от таблата на инкубатора), за да се изберат неоплодените. Яйцата от легхорн са най-удобни за вирусологична работа, тъй като тяхната тънка бяла обвивка ви позволява да видите по-добре съдържанието. Неоплодени яйца или яйца, съдържащи мъртви ембриони, се отстраняват от инкубатора. Делът на оплодените яйца варира значително в зависимост от много фактори, включително сезона: през пролетта е най-висок, през зимата е най-нисък.
Вторият път ембрионите са полупрозрачни в деня на планираната инфекция. Този период зависи от вида на вируса, както и от пътя на неговото въвеждане. Мястото на заразата се отбелязва върху черупката с обикновен (не мастилен) молив.
СТРУКТУРА НА ПИЛЕТО ЕМБРИО
Обикновено кокошката снася оплодено яйце, в което ембрионът е на етап бластула или ранен гаструла. Когато яйцето се нагрява до температура, близка до тази на тялото на кокошката, ембрионът се развива допълнително (фиг. 15). В периода от 5 до 12-ия ден на инкубация, ембрионите на пилета могат да се използват за заразяване с вируси.
Фигура 15 - Схематичен разрез на пилешки ембрион на 8-ия ден от инкубацията: 1 - черупка; 2 - черупка на черупката; 3 - хорионалантоисна мембрана; 4 - алантоисна кухина; 5 - жълтъчна торбичка; 6 - протеин; 7 - въздушна камера; 8 - тялото на ембриона; 9 - околоплодна кухина
Яйце с развиващ се пилешки ембрион е покрито отвън с твърда, пореста обвивка, към която плътно е прикрепена мембраната на черупката. Последният, в тъпия край на яйцето, е разделен на два листа, между които се образува въздушна камера. Тялото на ембриона лежи в яйцето ексцентрично, с гръб по-близо до черупката, главата насочена към въздушната камера. Ембрионът е потопен в амниотичната течност, която запълва околоплодната кухина, а пъпната връв е свързана с жълтъка. Жълтъкът също е разположен ексцентрично и спрямо ембриона, така да се каже, от другата страна на надлъжната ос.
Непосредствено под мембраната на черупката се намира алантоисната кухина, покриваща амнионната и жълтъчната торбичка и до 10-11-ия ден се затваря в острия край на яйцето. В процеса на развитие алантоисната мембрана расте заедно с хориона, образувайки единична хорионлантоисна мембрана (САО). В острия край на яйцето е останалата част от протеина.
Заразяването в една или друга част на ембриона се извършва през периода на максималното му развитие, когато броят на чувствителните клетки ще бъде най-голям.
В процеса на инкубация размерите на ембрионалните структури се променят, което до голяма степен се дължи на тяхното функционално предназначение и определя оптималната възраст на ембриона за инфекция.
И така, жълтъчната торбичка като резервоар хранителни веществаима най-голям обем в началото на инкубацията, а след това (след 12-ия ден), с развитието на ембриона, той намалява. Заразен в жълтъчната торбичка от 5-ия до 7-ия ден на инкубацията.
Амниотичната кухина, като буферна среда за развитието на ембриона, я покрива още на 5-ия ден от инкубацията. Средното количество течност към средата на инкубационния период е около 1 ml.
За инфекция в амниотичната кухина се използват ембриони на възраст 6-10 дни.
Алантоисната кухина служи за събиране на метаболитни продукти; в нея се натрупват соли на пикочна киселина, фосфор и азотни съединения. По време на растежа и развитието на ембриона алантоисната течност придобива кисела реакция. Алантоисната кухина достига максималния си размер на 9-12-ия ден от развитието на ембриона, поради което инфекцията в алантоисната кухина се извършва главно на 9-11-ия ден от инкубацията.
Хорионлантоисната мембрана е богата на кръвоносни съдове, които, прилепнали плътно към вътрешната повърхност на порестата обвивка, са наситени с кислород и ги снабдяват с тялото на ембриона, изпълнявайки функцията на дихателния орган на ембриона. KhAO достига максималното си развитие на 11-13-ия ден. Инфекцията върху хорионлантоисната мембрана се извършва на 10-12-ия ден от инкубацията.
ПОДГОТОВКА НА ПИЛЕЩИ ЕМБРИОСИ ЗА ИНФЕКЦИЯ
Ембрионите се транспортират от люпилнята, без да се охлаждат по пътя. В лабораторията ембрионите се инкубират в термостат при температура 37 ° C и влажност 60-70%, което се постига чрез поставяне на отворени съдове с широко гърло с вода в термостата. Вентилационните отвори на термостата трябва да са отворени. Ембрионите се поставят с въздушна камера нагоре в специални решетки. Препоръчително е да се позволи на ембрионите да се адаптират към новите условия през деня преди инфекцията и да се нормализират техните функции след транспортния стрес. Ако лабораторията разполага със собствен люпилня, то оплодените яйца, снесени от кокошката, са подходящи за снасяне в нея в продължение на 10 дни.
Подготовката на пилешки ембриони за инфекция включва овоскопия и дезинфекция на черупки, както и подходяща подготовка на работното място. Овоскопията включва разглеждане на яйца срещу достатъчно ярък източник на светлина (овоскоп), което води до сенки от вътрешни структури от неосветената страна на черупката (Фигура 16). Овоскопията се извършва в затъмнена стая. В същото време границата на въздушната камера, местоположението на ембриона и участък от аваскуларната зона с размери 0,5x0,5 см са маркирани върху черупката с графитен молив. Тези марки служат като ориентир при избора на мястото на инжектиране на ваксиниран материал. По време на овоскопията също се определя дали ембрионът е жив или умрял. Ембрионите, показващи активни движения с добро кръвонапълване на САО съдовете, се считат за живи.
Фигура 16 - Овоскопия на пилешки ембрион на 10-ия ден от инкубацията. Виждат се сенки: 1 - ембрион; 2 - жълтъчна торбичка; 3 - кръвоносни съдове на HAO; 4 - въздушна камера; 5 - катерица
Пилешките ембриони се заразяват асептично (за предпочитане в кутия). В камерата за предбоксиране обвивката на ембриона се обработва с йодиран алкохол, след което в кутията се изтрива многократно, а понякога и фламбирана - обработва се с пламък на тампон, напоен с алкохол.
Ембрионите се фиксират в специални стойки, монтирани в емайлирана кювета върху 3-4-слойна марлена салфетка, навлажнена с дезинфектант.
Те използват варени стерилизирани инструменти. Те се поставят в буркан с алкохол и се изгарят с пламък на горелка преди всяка повторна употреба.
Демонстрация
а) клинични признаци на заболяването при заразени лабораторни животни; б) методи за убиване на лабораторни животни; в) техники за аутопсия (насочете вниманието на учениците към състоянието на вътрешни органи) и методи за получаване на ваксиниран материал; г) техники за правене на мозъчни отпечатъци; д) действия за обеззаразяване на работното място и трупа след отваряне на заразеното животно.
Задачи
1. Да се изучи структурата на пилешки ембрион.
2. Проведете овоскопия на пилешкия ембрион, определете неговата жизнеспособност и маркирайте границите на сенките на естествените образувания.
3. Подгответе пилешки ембриони за инфекция.
Самостоятелна работа на учениците
а) разпознаване по цветен знак на мишки, заразени от всеки от учениците, анализ на клиничното им състояние, умъртвяване, фиксиране в кювета с восъчно (парафиново) дъно, отваряне; б) анализ на патологични промени, получаване на ваксиниран материал (паренхимни органи), подготовка на слоести мозъчни отпечатъци.
Учениците извършват овоскопия на пилешки ембрион, определят неговата жизнеспособност и маркират границите на сенките на естествените образувания.
Обобщаване на резултатите от урока
Задание за следващия урок
Контролни въпроси
1. Структурата на пилешкия ембрион.
2. За какво се използват пилешки ембриони във вирусологията?
3. Каква е структурата на развиващия се пилешки ембрион?
Откакто беше открито, че грипните вируси се размножават в ембрионите на пилета, този метод стана широко използван във вирусологията, тъй като е лесен за използване и не е скъп.
Използват се 7-9 дневни пилешки ембриони (пълният цикъл на развитие е 21 дни).
Преди заразяване, повърхността се третира с алкохол, йоден разтвор, в черупката се прави дупка и се заразява със стерилна спринцовка.
Методи на инфекция: в амниотичната кухина, в алантоисната кухина или в жълтъчната торбичка. Вирусите се размножават върху съответните мембрани, натрупват се в течността на кухината, която след това може да бъде събрана за по-нататъшни изследвания.
Ембрионите се култивират при 37 градуса. 3 дни, след това черупката се обработва отново, ембрионът се отваря със стерилни инструменти и ваксинираната течност се събира. Цялата работа по заразяване и дисекция се извършва в кутията.
Култивиране върху клетъчни култури.
Клетъчните култури започнаха да се използват във вирусологията през последните десетилетия, което направи възможно култивирането и изследването на много по-широк спектър от вируси, тъй като не всички човешки вируси могат да бъдат изолирани в животни или ембриони. По този начин съвременната вирусология използва клетъчни култури, от които е получено огромно разнообразие.
Сортове клетъчни култури
а) първичен -получени от ембрионална тъкан, чрез раздробяване, обработка с трипсин за дезагрегиране (разделяне) на клетки и по-нататъшно култивиране
in vitro в специална културална течност.
б) трансплантирани- получени от туморни тъкани, те се различават по това, че могат да се култивират неограничено, като се сменят само хранителната среда и ястията.
В процеса на отглеждане се получава монослой върху стъкло : т.е. един слой клетки.
Сега можете да заразите тези клетки с тестовия материал с предполагаемия вирус или вече съществуващи вируси. Ястия с клетки, заразени и неинфектирани, се култивират в термостат при 37 градуса.
Процесът на натрупване на вириони в клетъчната култура продължава приблизително 48 - 72 часа.
Чрез избора на подходящи култури могат да се култивират практически всички човешки вируси.
Следващият етап от изследването е индикацията и идентифицирането на вируси.
Методи за индикация.
Индикация -това е откриването на вируси директно в тестовия материал или в културалната течност или в заразени клетки.
I. Ако вирионите са в течност, те могат да бъдат открити с помощта на реакцията на хемаглутинация.
Същността на реакцията: някои видове вируси могат да спонтанно залепват (т.е. да причиняват хемаглутинация) на всякакви еритроцити. Например грипните вириони залепват пилешки еритроцити, някои аденовируси - еритроцити от плъхове и т.н.
По този начин, с помощта на суспензия от еритроцити във физиологичен разтвор, вирусите могат да бъдат открити във ваксинирана течност.
II.Ако вирусите се размножават в клетъчна култура, но са хемаглутиниращи, тогава те могат да бъдат открити с помощта на реакцията на хемадсорбция: суспензия от еритроцити се прилага върху културата, инкубира се и се източва - ако културата е заразена, тогава еритроцитите ще се прилепят директно към заразени клетки - това може да се види под светлинен микроскоп.
III.Други ефекти:
а) вирусите причиняват разрушаване на монослоя - това се нарича цитопатогенен ефект на вируса - CPP.
б) вирусите причиняват морфологични измененияклетки: вътреклетъчни или вътреядрени включвания, образуване на синцитий, симпласти (т.е. сливането на няколко клетки в една формация поради увреждане на клетъчните мембрани).
