Скоростта на ензимната реакция, с други думи, активността на ензима също се определя чрез присъствието в среда на активатори и инхибитори: първото увеличава скоростта на реакцията и понякога се променя, а вторият - реакцията се инхибира. Сред химичните съединения, засягащи активността на ензимите, се откриват различни вещества. Така, NC1 активира ефекта на пепсин, жлъчни киселини - панкреатична липаза; Някои тъкани ензими (оксидоредуктази, катепсини, аргиназа), растителен протеиназа папаин и др. До голяма степен, активирана от съединения, съдържащи свободни SH-групи (глутатион, цистеин), а някои и витамин С. особено като активатори сервират (изпъкнали) йони двувалентни и понякога едновалентни метали. Много ензими изобщо не са активни в отсъствието на метали. Така че, когато цинкът е отстранен, въглищната анхидраза е практически лишена от ензимна активност; Освен това, с действието на този ензимен цинк не може да бъде заменен с друг метал. Ензимите са известни, чието действие се активира от редица метали, по-специално, енолазис (виж въглехидрати) се активира от mg 2+, mn 2+, k +. В раздела. 18 показва примери за участие на металите в действието на някои ензими.
| Таблица 18. Метали при активиране на някои ензими 1 (1 Обикновено е трудно да се извърши границата между металните стопанства (металът е свързан изчерпателно N подчинен) и ензими, активирани чрез метали (последният само ускорява реакцията и лесно се дисоциират).) | |||
| Ензим | Метален | Ензим | Метален |
| Цитохром | Fe. | Амилаза | SA. |
| Катабас | Fe. | Липаза | SA. |
| Пероксидаза | Fe. | Carbanangeeza. | ZN. |
| Трипотофаноксидаза | Fe. | Лактат дехидрогеназа | ZN. |
| Хомогеник | Fe. | Urimaz. | ZN. |
| Аскорбатоксидаза | С. | Карбоксипептидаза. | ZN. |
| Тиросинеза | С. | Пептидаза | Mg. |
| Фенол оксидаза | С. | Фосфатаза | Mg. |
| Xantina Oxidasis. | Мост | Фосфоглюкокиназа | Mg. |
| Nitratreductaza. | Мост | Аргина. | Mn. |
| Алдехидоксидаза | Мост | Фосфоглукукукутаза | Mn. |
| Пептидаза | ТАКА | Holinesterase. | Mn. |
Що се отнася до ролята на метали в активирането на действието на ензимите, наличните данни предполагат, че в някои случаи метални йони (CO 2+, mg 2+, Zn 2 +, Fe 2+) изпълняват функциите на обвиниемите групи от ензими. В други случаи те допринасят за присъединяването на субстрата към активния център и образуването на ензим-субстратния комплекс. Например, mg 2+ йони през отрицателно заредена фосфатна група осигуряват добавяне на органични вещества монофосфорни естери към активния център на фосфатазите, катализиращ хидролизата на тези връзки. В някои случаи металът е свързан към субстрата, образувайки истински субстрат, към който ензимът действа. По-специално, mg 2+ йони активират креатин фосфокаин поради образуването на истински субстрат и магнезиева сол АТР. И накрая, съществуват експериментални доказателства за пряко участие на метали (например, СА 2+ йони в молекулата на слюнката амилаза) при образуването и стабилизирането на активния център и цялата третична структура на ензимната молекула. Трябва също да се отбележи, че не-разделената роля на Медлов като алто на модулаторите (виж фиг. 59). Взаимодействайки с алостеричния център, такъв метал (модулатор) допринася за образуването на най-изгодната пространствена конфигурация на ензима и активния ензим-субстрат комплекс.
Анионите във физиологичните концентрации обикновено са неефективни или имат лек активиращ ефект върху ензимите. Изключенията са пепсин, някои оксидоредуктази, активирани от аниони, както и слюнче амилаза, катализираща нишестена хидролиза, активността на която се издига чрез хлорни йони и аденилатни циклаза, която се активира от аниони на халоген.
Инхибитори Обичайно е да се наричат \u200b\u200bвещества, които причиняват частично или пълно инхибиране на реакциите, катализирани от ензими. Тъй като ензимите са протеини, всички агенти, причиняващи протеинови денатуриране (нагряване, киселини, алкални, соли на тежки метали) водят до инактивиране на ензима. Такова инактивиране обаче е относително неспецифично. Тя не е свързана с механизма на действие на ензимите. Много по-голяма група е така наречените специфични инхибитори, които имат свои собствени действия за един ензим или група свързани ензими. Изследването на тези инхибитори е от съществено значение за редица причини.
Първо, инхибиторите могат да осигурят ценна информация за естеството на активния център на ензима, както и неговите функционални групи и химични връзки, които осигуряват образуването на ензим-субстратния комплекс. Има вещества, специфично свързани с една или друга група в ензимната молекула, обръщайки го от сферата на химическата реакция. По-специално, йодацетат ISN 2-договор, неговият амид и етилов етер, парахлоринокурибензоат CLHG - С6Н4 -Конун и други реагенти са относително лесно спряно в химическа връзка с някои SH-групи ензими. Ако такива групи са от съществено значение за акта на катализа, добавянето на такива инхибитори води до това пълна загуба Ензимна дейност:
R-SH + ISN 2-Couroon -\u003e Hi + R-S-CH 2-така
Редица други ензими (холинестезаза, трипсин и химотрипсин) са много инхибирани от някои фосфорни съединения, по-специално диизопропилфлуорофосфат (DFF), поради блокиране на ключовата хидроксилна група от серия в активния център (виж по-горе).
Второ, намерени инхибитори широко приложение В ензимологията, в проучването на естеството на множество форми на ензими и изоензими, не се различават не толкова върху електрофоретичната мобилност, както в разликата в реакциите към същия инхибитор.
С помощта на инхибитори, селективно превключване на отделни етапи на многостепенния метаболитен процес, последователност от химични реакции и естеството на участващите ензими могат да бъдат точно инсталирани. По-специално, с това, с използване на йодацетат, флуорид и други инхибитори, гликолитният път на окисляването и редуциращите трансформации на глюкоза към млечна киселина в мускулната тъкан е дешифриран (виж обмена на въглехидрати), номериране на 11 етапа с участието от 11 ензима и 10 междинни метаболита.
На инхибиторността на ензимите се основава механизмът на действие на много токсини и отрови върху тялото. Така че е известно, че в отравяне със синя киселина смърт се дължи на пълното инхибиране на респираторните ензими (цитохромен оксидаза), особено мозъчните клетки. Токсичният ефект върху човешкото тяло и животните на някои инсектициди се дължи на спирането на активността на холинестераза - ензим, възпроизвеждащ основна роля в активността на нервната система.
Рационална химиотерапия - съзнателно приложение лекарствени препарати В медицината, трябва да разчитат на точното познаване на механизма на тяхното действие, върху биосинтезата на ензимите или тяхната работа в организма. Понякога методът на лечение на човешки заболявания включва използването на електорални инхибитори. Така, трипсин, инхибитор на химотрипсин и каликрейна трасилол се използва широко при лечението на остър панкреатит. Селективният инхибиторен ефект върху ензимите на някои естествени и синтетични съединения (така наречените антиметаболити) понастоящем е основата за разработване на ефективни методи за синтеза на химиотерапевтични лекарства. Съществуват обширни възможности за регулиране както на синтеза на ензимите, така и на метаболитни интензитет.
Видове инхибиране. Въпреки факта, че механизмът на действие на повечето инхибитори не е изяснен, обикновено отличава обратимо и необратимо инхибиране. Ако инхибиторната молекула причинява постоянни промени или модификация на функционалните групи на ензима, тогава този вид инхибиране се нарича необратим. По-често обаче има обратимо инхибиране на количествено проучване, основано на уравнението на Michaelisa - Menten. Реверсивното инхибиране на свой ред е разделено на конкурентни и неконкурентни, в зависимост от това дали е възможно или не може да се преодолее спирачките на ензимната реакция чрез увеличаване на концентрацията на субстрата. Във втория случай увеличението на концентрацията на субстрата не променя степента на инхибиране на ензима.
Конкурентното инхибиране може да бъде причинено от вещества, които имат структура, подобна на субстрат, но малко различна от структурата на истински субстрат. Класическият пример за този тип инхибиране е спирачването на активността на сукцинат дехидрогеназа с малонова киселина. Този ензим катализира окислението чрез дехидрогениране на янтарната киселина в фумароич в съответствие със схемата:
Ако има медална киселина (инхибитор) в сряда, след това чрез структурното сходство на нея с истинска субстратна кехлибарена киселина (присъствието на две от същите йонизирани карбоксилни групи) тя ще реагира с активен център, за да образува ензимен инхибитор Комплекс (виж схемата), но тази стойност на водород от малонат не се случва. Тъй като структурата на субстрат - кехлибарена киселина и инхибитор - малонатите все още са малко по-различни, те се конкурират за свързване към активния център, а степента на спиране ще бъде определена чрез съотношението на концентрациите на малонат и сукцинат, а не абсолютната концентрация на инхибитора. Този тип инхибиране понякога се отнася за инхибиране чрез тип метаболитен антагонизъм (фиг. 56).
В обща форма. Реакцията на взаимодействието на инхибитор с ензим може да бъде представена от следното уравнение:
Полученият комплекс, наречен ензим-инхибиращ комплекс (EI), за разлика от ES не се разпада с образуването на реакционните продукти. Константата на дисоциацията на комплекса EI или инхибиторна константа (k1) може да бъде последвана от теорията на Michaelis - да се определи, за да се определи като съотношение на константи на гърба и директните реакции:
i.e., инхибиторната константа е пряко пропорционална на продукта на концентрацията на ензима и инхибитора и обратно пропорционална на концентрацията на комплекса EI.
Конкурентният метод на спиране се използва широко в медицинската практика. Известно е например, че за лечение на някои инфекциозни заболявания, причинени от бактерии, се използват препарати сулфонамид. Оказа се, че тези лекарства имат структурно сходство с пара-аминобензоената киселина, която бактериална клетка Използване за синтез фолиева киселинакоято е неразделна част от ензимите на бактериите. Благодарение на тази структурна прилика, сулфониламид, например, блокира ефекта на ензима чрез разместване на пара аминобензоена киселина от комплекса с ензимна синтезираща фолиева киселина, което води до спиране на растежа на бактериите.
Някои аналози на витамин В 6 и фолиева киселина, по-специално дезоксипиридоксин и аминоптерин (виж витамини), действат като конкурентни, така наречените когонински инхибитори (или антивитамини), които се инхибират от много биохимични процеси в тялото.
Неконкурентно инхибиране Той е причинен от вещества, които нямат структурни прилики със субстрати и често се свързват с активния център, а другаде на ензимната молекула. Степента на спиране в много случаи се определя чрез продължителността на действието на инхибитора на ензима. С този вид инхибиране поради образуването на стабилна ковалентна комуникация. Ензимът често е пълно инактивиране, а след това спирането става необратимо. Примери за неконкурентно инхибиране (инактивиране) е ефект на йодацетат, диизопропилфлуорфосфат, както и диетил-N-N-нитрофенил фосфат и синтейна киселина, която се състои в свързване и изключване на функционални групи или метални йони в ензимната молекула.
За да се изясни въпросът за вида на инхибицията, използвайте уравнението на Michaelis - модерно уравнение, линията на линувъра и други по-напреднали уравнения, например, EDI - HOFSTI уравнение:
v \u003d - до m (0 / [s]) + v mach
и съответните графики в праволинейни координати. В следните графики, конструирани в координатите V и [S], както и в координатите 1 / V и 1 / [S], V - максималната скорост на реакцията, V1 е максималната скорост в присъствието на инхибитор, \\ t до 1 - инхибираща константа; Всички други знаци бяха представени по-горе.
Може да се види, че с конкурентен тип инхибиране (Фиг. 57) инхибиторът увеличава стойността на m (чрез стойност, равна на разликата в дължината на сегментите, които се отрязват от оста на абсциса), без да се засяга максималната скорост. Това означава, че с достатъчно висока концентрация на субстрата [s] инхибиторът е изместен от субстратните молекули от комплекса EI. При неконкурентно инхибиране (Фиг. 58), инхибиторът намалява максималната скорост. Ако стойността на m не намалява, тогава те говорят за напълно неконкурентно инхибиране. Такъв тип инхибиране възниква при образуването на неактивни, трудни разтварящи се комплекси EI и (или) EIS. Често, обаче, има смесен вид инхибиране (понякога се нарича частично неконкурентен тип), при който намаляването на V MAC е комбинирано с увеличаване на m. Това означава, че комплексът EI запазва частична активност, т.е. способността за образуване на междинен тройно комплекс EIS, в който субстратът се подлага на бавна каталитична трансформация. В редки случаи степента на инхибиране на ензимната активност може да се увеличи с повишаване на концентрацията на субстрата; За този тип спиране се предлага доста неточен термин (от английския неправомерно). Един от механизмите на такова спиране се дължи на възможността за свързване на инхибитор с ес комплекс, за да се образува неактивен или бавно реагиращ троен комплекс ESI.
Така, с графичен анализ на скоростите на ензимните реакции като функция на концентрациите на субстрата, може да се получи ценна информация за кинетиката на ензимните реакции, осветявайки възможния механизъм на ензимната катализа.
Регулиране на ензимната дейност
Беше отбелязано по-горе, че една от уникалните свойства на живите организми е невероятна способност да балансира катаболичните (биоразградски) и анаболни (биосинтетични) процеси. Въпреки че синтезът, разпадването и взаимните разтвори на стотици и хиляди различни вещества се осъществяват едновременно в клетките, съществуват много регулаторни механизми, които осигуряват постоянство на вътрешната среда на тялото. Някои от тези регулаторни механизми, сред които важна роля принадлежи на механизмите за регулиране на дейността на ензимите, ще бъдат разгледани по-долу.
Въздействието на закона действието на масите. В обратимата химическа реакция, катализирана от ензима, например, A + B C + D, концентрацията на реакционните компоненти и съответно реакционната посока ще бъде регулирана от ефекта на закона действието на масите. Тя, по-специално, може да бъде показана в обратима реакция на трансаминация, катализирана от аланиновата субстрансфераза:
Alanine + α-кетоглутат е пируват + глутамат.
Този вид регулиране играе, очевидно само ограничена роля, тъй като в реални условия реакцията обикновено тече в една посока, тъй като образуваните продукти могат да се окажат субстрати за действие на други ензими и получени от реакционната сфера; В тези случаи се установява стабилно (неподвижно) състояние, а не истински баланс.
Променете броя на ензима. Бактериите изследват феномена на индуцирания синтез на ензимите по време на отглеждането на тях на средата, където един или друг въглехидрати се сервира от единствения въглерод и енергиен източник, оставя глюкоза. Замяната на глюкоза в лактоза води до индуцирана или адаптирана (след малък период на лагфазиса) синтеза на галактозидазен ензим (програментен геном на лактоза, виж протеиновия синтез), разделяйки лактоза върху глюкоза и галактоза. При животински тъкани, такъв бърз синтез на ензимите се наблюдава относително по-рядко и механизмът, индуциран от синтеза, се изследва само за малък брой ензими (тиросенезамаминази, серин и тринирейстеридрат, триптопанпиролаза и др.). Въпреки това, когато влизате в тялото на някои отрови, канцерогенни вещества, алкалоиди, инсектициди и т.н. Има рязко увеличение след няколко дни активност (съответно) ензими - хидроксилазен гладък ендоплазмен ретикулум на чернодробните клетки; Окисляващи чужди вещества в нетоксични продукти за тялото. От друга страна, случаите са описани, когато при действието на подобна хидроксилаза чужди вещества се превръщат в тялото в по-токсични съединения. Това явление, обратна детоксикация, се нарича смъртоносен синтез.
Респимент. Протелитични ензими стомашно-чревния тракт и панкреасът се синтезират в неактивна форма, под формата на про-фериси (зимуване). Регламентът в тези случаи се свежда до преобразуването на прообиването в активни ензими Под влиянието на конкретни агенти. Така трипсинът се синтезира в панкреаса под формата на трипсиноген. Последният се превръща в активна трипса в червата под действието на друг протеинов ензим - ентерокиназа, първо отворен в лабораторията I. P. pavlov. Установено е, че активиращият ефект на ентерокиназата се редуцира до разцепване на хексапептид от трипсиногена, което води до образуването на естествената третична структура на трипсин и неговия активен център (виж по-горе); Наблюдава се и над операцията. Превръщането на неактивен пепиноген в активен пепсин се извършва автокаталитично в резултат на ограничена протеолиза в присъствието на NC1 и също е свързано с разцепване на първия специфичен инхибитор на полипептидната природа (виж обмена на прости протеини). Синтезът на протеинази в неактивна форма и редица други неактивни прекурсори протеини, очевидно, определено биологично значение, предотвратяващо унищожаването на органи на органи, в които се формират профили.
Симмична ензимна модификация. Посоченото по-горе (виж химията на протеините), която редица протеини при образуването на третична структура претърпяват постсинататична модификация. Оказа се, че ключовите ензими на енергийния метаболизъм - фосфорилаза, гликогенеза и др. - също се контролират чрез фосфорилиране и дефосфорилиране, извършени чрез специфични ензими - протеинзаза и протеинова фосфатаза, нивото на активност от която от своя страна се регулира от хормони ( Вижте обмена на въглехидрати). Нивото на активност на ключовите ензими и съответно интензивността на обменните процеси ще бъде определена чрез съотношението на фосфорилирани и дефосфорилирани форми на тези ензими.
Регулиране на ензимната дейност върху принципа на обратна връзка. При много строго биосинтетични реакции основният тип регулиране на скоростта на многостепенния ензимен процес инхибира принципа на обратната връзка, когато крайният продукт на биосинтетичната верига потиска активността на ензима, катализиращ първия етап.
Да предположим, че в клетките се извършва многостепенният биосинтетичен процес, като всеки етап от който се катализира от собствения си ензим:
Скоростта на такава обща последователност от реакции до голяма степен се определя от концентрацията на крайния продукт (Р), чиято натрупване над допустимото ниво има мощен инхибиторен ефект върху първия етап на процеса, съответно до ензима e 1.
За първи път съществуването на такъв механизъм за контролиране на активността на ензимите чрез метаболити е показан в Е. coli в изследването на синтеза на изолевцин и цитидитриитрифосфат (CTF). Оказа се, че изолевцинът, който е ограничен продукт, селективно потиска активността на тронидархадрата, катализирайки първата връзка на процеса на превръщане на треонин в изолевцин, който има пет ензимни реакции. По същия начин, CTF като ограничен продукт на биосинтетичната пътека има инхибиращ ефект върху първия ензим (аспартаттранскарбамоилаза), като по този начин регулира собствения си синтез. Този тип инхибиране се нарича инхибиране на принципа на обратна връзка или ретронг. Неговото съществуване се доказва във всички живи организми и в момента се счита за един от водещите видове регулиране на активността на ензимите и клетъчния метаболизъм като цяло 1. (един Трябва да се покаже, че скоростта на реакцията (както и активността на ензимите) в чисто биоразградими (катаболни) процеси се регулира от междинни продукти, които са индикатори на енергийното състояние на клетката (пуринови нуклеотиди, пирофосфат, неорганичен фосфат и др. ).)
От друга страна, в амфиболичните процеси (виж въвеждането на вещества и енергия), извършващи едновременно време биосинтетични и биоразградими функции 2, наличието на регулиране се доказва както от вида на ретроинхинихи и макро пръти - показатели на енергийното състояние на клетката. (2. Амфилолните процеси включват начини като гликолис, гликогенелиза, цикъл на трикарбоксилна киселина, хексозомонофосфат път, аминокиселинна трансаминация (виж метаболизма) \\ t). За амфибологични процеси, уникалният тип регулиране, присъщ само на него, е, че активирането на прекурсора, когато първият метаболит в многостепенния път се активира от ензима, катализирайки последния етап. Така се доказва активиращото влияние на глюкоза-6-фосфат, което е прекурсор на гликоген, към ензимния гликогенксинтаза.
Такива видове инхибиране на крайния продукт и активиране се характеризират с алтораектични (регулаторни) ензими (виж по-горе), когато ефектът, структурно разлика от субстрата, е свързан със специален (алтецептен) център на ензимната молекула, пространствено отдалечено от Активният център. Следователно е обичайно да се прави разлика между вида на Алто-клетки на регулиране, включително инхибиране на Altowork и Alto-Solid Activation. Взаимните приключения на активния и неактивния ензим на Altowork в опростена форма, както и конформационни промени, наблюдавани, когато субстратът и ефекторите са прикрепени, са представени на фиг. 59.
Може да се види, че прикрепването на отрицателния ефектор към алостеричния център причинява значителни промени в конфигурацията на активния център на ензимната молекула и в резултат на загубата на афинитет на ензима към неговия субстрат (образуването на неактивен комплекс).
Алостеричните взаимодействия се проявяват в естеството на кривите на началната реакционна скорост на реакцията от концентрацията на субстрата или ефектора, по-специално в S-образите на кривите (отклонение от хиперболичната крива на Michaelis - Menten). Това означава, че свързването на една субстратна молекула улеснява свързването на втората молекула в почти лебедния център, като по този начин допринася за увеличаването на скоростта на реакцията. В допълнение, за регулаторни (алтораещи) ензими се характеризира нелинейна зависимост от скоростта на реакцията от концентрацията на ензима.
Други видове регулиране на ензимната дейност. Съществуват редица други механизми, които контролират скоростта на метаболитните процеси и активността на вътреклетъчните ензими. Такива механизми могат да включват конкуренция на ензимите за общия субстрат, изключването на активността на един от нуфофремите (в множество форми на ензими), влиянието на концентрациите на кофакторите и техните форми (особено метални йони) и феномена на отделение . Механизмът на разделяне на помещенията, очевидно, важна биологична роля, пространствено изключване чрез биомембранни ензими от нейните субстрати (например лизозомни ензими: протеинази, фосфатази, рибонуклеази и други хидролитични ензими, от вещества, към които те действат в цитоплазмата) или взаимно несъвместима в същото време метаболитни процеси. Пример за последното може да бъде пътищата на синтеза на мастни киселини, които текат главно в разтворимата фракция на цитоплазма, а пътта на дезинтеграция на мастните киселини, фокусирани в митохондриите.
Определяне на ензимната активност
Определянето на количественото съдържание на ензимите в биологични обекти представлява известни трудности, тъй като, с редки изключения, ензимите в тъканите присъстват в незначителни концентрации. Следователно броят на ензимите се оценява по степента на катализирана реакция, в определени последователни условия на измерване. При оптимални условия на температура рН на средата и пълната насищане на ензима от субстрата, скоростта е пропорционална на ензимната концентрация. Скоростта на ензимната реакция се оценява или чрез скорост на загуба на субстрата или със скоростта на образуване на реакционния продукт.
За изразяване на концентрацията на ензима от ензимската комисия на Международния биохимичен съюз се препоръчва стандартна единица (Е). За единицата на всеки ензим се приема количеството, което при оптимални условия катализира превръщането на 1 μmol на субстрата на минута (μmol / min). Новата дефиниция на международната единица на виличния ензим (CAT, KAT), съответстващ на броя на ензима, който може да причини превръщането на 1 мол от субстрата към продукта в 1 s (1 mol / s). Съотношението на международната единица (е) до Katal може да бъде изразено, както следва:
или 1 e \u003d 1 μmol · min -1 \u003d (1/60) μmol · С-1 \u003d (1/60) μcat \u003d 16.67 NKAT. По този начин, ензимът INE съответства на 16.67 NKAT.
Препоръчва се, в допълнение, измерването на ензимните единици при 25 ° С, оптималното рН и концентрацията на субстрата, надвишаващ концентрацията на насищане. В тези случаи скоростта съответства на нулевия ред на реакцията срещу субстрата и ще зависи от концентрацията на ензима.
Да се \u200b\u200bизразява активността на ензима, използвайте определението за специфична и молекулярна активност. Специфичната активност на ензима се приема за експресиране на броя на ензимните активност на 1 mg протеин (или броя на ролките на 1 kg активен протеин). Броят на молекулите на субстрата, подложен на превръщането на една ензимна молекула на минута, е обичайна, наречена броя на оборотите или молекулярната активност. Така една молекула на еритроцит каталаза може да се разделя в 1 min 5 · 10 6 молекули на водородния пероксид 1. (един За 1 атом от неорганично желязо, също катализиращ разпад Н202, разцелен такъв брой молекули Н202, което разделя каталаза в 1 С, ще изисква повече от 300 години. Този пример е визуално доказателство за едно от основните свойства на ензимите - тяхната висока каталитична активност.)
Методите за релаксация се основават на принципа, че с бързо външно въздействие върху системата (промяна в температурата, налягането и т.н.) времето, през което системата трябва да постигне ново равновесие (или неподвижно състояние), зависи от скоростта на химическата реакция ( а понякога и върху скоростта на дифузия на реагентите.
Разгледайте най-простата реакция на комплекса на активния център на ензима с лиганда
В началото системата е в равновесие, която се характеризира с равновесна константа К. 0 =К.(T. 0) и според равновесните концентрации 
,
,
. Да предположим, че температурата се променя драматично T.->T. 0 +T.. Това води до промяна в равновесната константа К.->К. 0 +К.определено от отношението
(2.50)
където . Х.- стандартна промяна в енталпия. След това системата влиза в ново равновесно състояние:
(2.51)
(2.52)
Уравнение (2.51) е нелинейно. Да предположим, че отклонението от равновесие е малко и след това
и уравнението (2.51) се превръща в линейно диференциално уравнение:
Решение на това диференциално уравнение:
Стойност
(2.54)
наречено време за релаксация.
2.5. Ефекта на температурата и рН за скоростта на ензимните реакции
Влиянието на тези фактори върху скоростта на елементарна химична реакция се разглежда в СН.1. Особеността е, че ензимните реакции са сложни многостъпални реакции (състоящи се от много елементарни реакции). В допълнение, състоянието на ензимните молекули в разтвора се характеризира с набор от конформер, обратимо преминаване във всеки друг. Конформационните преходи на молекулата се определят до голяма степен от температурата и фаразата.
2.6. Инхибиране на ензимните реакции
Вещества, преобладаващи каталитичната активност на ензимите инхибитори . Разграничават два основни инхибитора на класа - обратим
(2.55)
(Пестициди, Зарин, Зоман, аспирин и др.)
и необратим (инактиватори )
(2.55)
(въглероден оксид, цианиден йон, аналгин и др.)
2.7. Инактивиране на ензими
Биополимерните молекули (ензими) са термодинамично нестабилни и като правило с течение на времето променят структурата и свойствата си. В повечето случаи процесът на инактивиране може да бъде описан като преход между двете състояния на ензима Д. а. И неактивни Д. i. :
(2.56) Кинетиката на процеса е описана от съответното диференциално уравнение
(2.57)
и характеризира времето за постоянно
(2.58)
Процесът на инактивиране на ензима може да има различна физико-химична природа. Най-често срещаната е топлинна денатурация, която е значително преструктуриране на макромолекулата, промяната в третичната и частично вторичната структура.
За целите на инактивиране може да се използва кавитационен ултразвук, радиоактивно излъчване и др.
Промяната в Фаел може да доведе до денатуриране на ензима. С всяка стойност тя се характеризира с подходящо разпределение на зареждане (йонни групи). С много ниски или много висококачествени заряди, молекулата може значително да поляризира, да доведе до появата на изомери и необратимо да го съобрази с унищожаването на структурата на активния център. Например:
Денатурацията на ензима причинява и денатуриращи агенти, унищожаване на вторичната структура на протеина (например урея), както и оксидативни процеси, включващи кислород.
При изучаване на такива процеси важна информация беше получена чрез методи за релаксация. Като правило, конформационните промени са придружени от промяна в околната среда на ароматни аминокиселини - тирозин и триптофан (радиационна абсорбционна лента с 290 nm). Това се проявява в промяната на абсорбцията и флуоресцентен спектрата.
Реверсивните конформационни промени обикновено отиват с времето 0,1-100 ms и необратимо - 1-1000 min.
Пример 1. Най-простата кинетична диаграма на инактивирането с равновесие на конформите:
(2.59)
Кинетиката на процеса е описана с едно характерно време.
(2.60)
Пример 2. Инактивирането също е обект на и на доверие:
(2.61)
(2.62)
Пример 3. По-общ случай за система с участие н.конформира:
Често ензимите в разтворите образуват димери, а в димерната форма се оказват по-стабилни. След това се наблюдава дисоциативен механизъм на инактивиране :
(2.65)
Следващата схема отразява възможните инактивиращи механизми по време на реакционния процес (мономолекулно инактивиране на свободната форма на ензима, мономолекулно инактивиране на съединения с фурен-субстрат, бимолекулната инактивация на ензима от субстрата, бимолекулно инактивиране на ензимния продукт):
(2.66)
Дискриминацията на инактивиращи механизми и определяне на кинетичните характеристики на реакцията обикновено се извършва по няколко метода:
анализиране на зависимостта на продукта от концентрацията на ензима;
за установяване на връзката на степента на превръщане на субстрата със степента на инактивиране на ензима;
реакция при ниски степени на превръщането на субстрата и ниските концентрации на ензима;
реакция при големи ензимни концентрации;
предварително инкубиране на ензима с реакционни компоненти;
използването на уравнения на интегрални реакции.
Haugaard. През 1946 г. той показва, че ензимите, чиято дейност зависи от наличието на намалени форми на сулфхидрилни групи, необичайно чувствителни към токсичния ефект на кислород. През 1972 г. Tjiae, Haugaard сключи за връзката на инактивирането на такива ензими под действието на O2 под абсолютно налягане от 5 kgf / cm2 с изчезването на активни сулфхидрилни групи.
В белите дробове на на плъх Под въздействието на хипероксия (Pio2 \u003d 5 kgf / cm2), активността на хидрогеназа и съдържанието на сулфхидрилни групи се намалява значително след 15-30 минути на експозиция, а не макроскопични, но в тъканите бяха отбелязани само малки микроскопични промени. След 45 минути експозиция се наблюдава увреждането на белите дробове и увеличаване на съдържанието на бисулфиди.
Освен това ензимиСъдържащи активни сулфхидрилни групи под влиянието на хиперокси, както е известно, много други ензими са инактивирани. Възможно е също така потенциално активните радикали да причинят необратими лезии на пептидни вериги и особено аминокиселини.
Фуроксидация LLPIDS.
Взаимодействие ненаситени Липидите с отразен анион или с някои други свободни радикали могат първоначално да доведат до освобождаване на липид радикал, а след това в резултат на самостоятелно изследване в присъствието на кислород, образуват липиден пероксиден радикал. По-нататъшното взаимодействие на липид пероксид с други липиди може да регенерира липидните свободни радикали и пероксидационни съединения, като по този начин причиняват верижна реакция и прогресивно възпроизвеждане на липиди.
Ковачич, Мишра. (1980) показват, че препълването на липиди в участъците на мозъка на плъховете се появява дори по време на експозицията при условия на нормално налягане на въздуха с натрупването на пероксидни съединения в средата, както и в вътреклетъчната течност. Въпреки че размножаването на липида, причинено от действието, все още не се демонстрира с определена яснота in vivo, има съобщения в литературата, че може да се появи в мозъчната тъкан, червените кръвни клетки, жабата и в изолиран плъх.
В литература Има много съобщения, които активните транспортни системи, свързани с мембраната, са склонни да деактивират под влиянието на кислород. Именно е установено, че консумацията на поливоли на глутаминова киселина зависи от транспортната система, свързана с прехвърлянето на калий. През 1957 г., Kaplan, Stein на секции на церебралната кора от морски свинчета, изложени на кислород при абсолютно налягане от 6 kgf / cm2 за 90 минути, установяват както нарушават процесите на консумация на соли на глутаминова киселина и натрупване на калий.
Подобен закони Бяхме инсталирани през 1970 г. Джойни и служители на кортикални участъци на мозъка, подложени на кислород при абсолютно налягане в диапазона от 1-10 kgf / cm2. От литературните съобщения е известно и за увреждането на активния транспорт на натрий в получаването на жаба балон и в изолирана капачка на жабата под влиянието на хипероксия. През 1973 г. Алън и служителите стигнаха до заключението, че най-вероятният механизъм на инактивиране на натриев транспорт под влиянието на кислород се състои в образуването на междинен липид пероксид.
За нарушение натрий Помпата на помпата в кортикални секции, взети при плъхове, подложени на хиперокси при абсолютно налягане 4 kgf / cm2, показва наблюдаван феномен на инактивиране на Na-K-Atpase.
Учене как серотониваТака че аз съм адреналин крадец в изолиран перфузируем белодробен приготвяне, взет при плъхове, подложени на кислород при абсолютно налягане 1 kgf / cm2, намалява. И двете от тези промени са значителни в рамките на 12-24-часовата експозиция, т.е., много преди началото на структурните увреждания или появата на клинични симптоми на отравяне с кислород на белите дробове.
Обратно, освобождаване имипрамин Не се променя в изолирани бели дробове при плъхове, които дишат с чист кислород при нормално атмосферно налягане за около 48 часа. Получените резултати са в съответствие с възможността за активно транспортиране на серотонин и норепинефрин в ендотелни клетки на белодробни капиляри, докато отстраняването на имипрамин възниква чрез пасивно свързване. Освен това цитираните автори установиха, че токсичният ефект на кислорода върху мембраната на ендотелните клетки се прилага или не един носител или някои от основните компоненти, участващи в транспортирането на двата амини.
Един от целите за обработка е инактивирането на ензими. Термичната стабилност на ензимите е сравнима с съпротивлението на микроорганизмите. Поради тази причина ензимите могат да бъдат инактивирани чрез термична обработка, както в случай на микроорганизми.
По време на пастьоризацията на киселинни продукти, като отменени зеленчуци или плодови сокове, следните видове ензими могат да бъдат инактивирани: пектинметилстеразис и полигалактурия. Инактивирането на ензими в тези продукти е по-важно от унищожаването на микроорганизмите.
Някои видове ензими са много термични, например, топлоустойчиви ензими, произведени от психоид бактерии. Тези ензими (липази и протеази) могат да ограничат времето за съхранение на UHT продукти, като например млякото.
Понякога интензивността на топлинните процеси се основава на инактивирането на някои ензими, които се наричат \u200b\u200bензими на индикатора:
При балансиране на зеленчуци: пероксидазен ензим (понякога каталаза или друг);
Когато пастьоризацията на мляко: фосфотаза или пероксидаза, тези индикаторни ензими ви позволяват да класифицирате млякото според интензитета на топлинна обработка (Фигура 2.9).
Фигура 2.9 - Инактивиране на млечни ензими.
2.9 Оптимизиране на термични процеси на обработка
Стойности D и Z хранителни вещества И показателите за качество обикновено са по-високи, отколкото в микроорганизмите. Този факт ви позволява да оптимизирате процеса на термична обработка към инактивирането на микроорганизми и в същото време да поддържате показатели за качество.
Условията зависят от вида на процеса, но като цяло най-добри резултати дават интензивен краткосрочен процес. Таблица 2.5 показва загубата на витамин 1 по време на стерилизация.
Лесно е да се постигне оптимизиране на процеса на стерилизация на конвективни отопляеми продукти. За течности с малки частици в суспензия или без тях, най-доброто решение е ултра-висока температура.
Таблица 2.5 - Витамин Витамин Загуби по време на стерилизация
2.10 Оценка на стойностите F 0
Необходима стойност F 0.зависи от вида на продукта и включва няколко фактора. РН на продукта е от голямо значение. Колкото по-голяма е киселинността на продукта, толкова по-малко твърд стерилизационен режим.
Обхваща диапазон 4 RH киселинност.
В допълнение към унищожаването на микроорганизмите, стойността на рН означава също:
Термичното лечение е по-малко интензивно, ако продуктът е намалил киселинността на рН;
РН 4.5 е критично: това е най-ниското ниво на рН, което прави височината C.Ботулинум. Ако стойността на рН е по-голяма от 4.5, избраният процес може да доведе до пълна инактивация C.Ботулинумили 2,45. F 0 - 3 F 0.
Стойността на рН от 4.1 е най-ниската за стерилизация. В диапазона на рН от 4.1-4.5 се прилага лечение 1 F 0.. В RN.<4,1 нет необходимости проводить стерилизацию, т.к. пастеризация обеспечивает необходимый срок хранения и промышленную стерильность. Интенсивность процесса пастеризации часто определяется активностью ферментов, не микробиальной активностью.
Таблица 2.6 - Класификация на консервирани храни в съответствие с рН.
Термофилни микроорганизми и характерни растенияВсички въздействия, водещи до инактивиране на ензимите, понякога обикновено се разделят на физически и химически. Физически са отопление или свръхкожност, облъчване (u-и рентгенография), ултразвук, сорбция
границите на фазовия участък (тип вода - въздух или течност-и). Химичното инактивиране може да бъде причинено, например, алкали към киселини, повърхностно активни вещества, органични разтворители, карбамид и гуанидин хлорид, някои окислители (например, кислород или водороден пероксид) и редуциращи агенти (например, тиола, метални йони), а също и някои ензими (например, протеази или протеинови кинази). Въпреки това, опит за класифициране на инактивационните процеси въз основа на условното разделяне на инактивирането на въздействията върху физически и химически, практически нищо, за да се разбере същността на тези процеси. Например, при действието на физически фактор (отопление), химичните промени често се появяват в протеиновата молекула; Окисляването на функционални групи, хидролиза на пептидни връзки, от друга страна, ефекта на такива химични дена-трева, като карбамид или фюанчин хлорид, като правило променя промените само от физическото състояние на протеина (разумно регулиране) , но не променя химическата си структура.
Повече информативен, по отношение на решаването на стабилизационната задача, е класификацията на инактивационните процеси върху молекулярни механизми.
§ 2. Молекулни механизми на инактивиране на ензими
Обратно през 40-те години - - началото на 50-те години, основните идеи за механизмите на инактивиране бяха установени. В най-общия случай инактивационният процес може да бъде представен като двуетажна схема:
където n, d и 1-съответно местни, обратими денатурирани и необратими неактивни форми на протеин *. Първият етап в схемата (!) Най-често е обратима конформационна промяна; В случая на олигомерни ензими този етап се състои в обратимо дисоциация върху субединицата. След обратими процеси, необратимите етапи (D-L) продължават< Механизмы инактивации ферментов, как правило, классифицируют, исходя из природы процессов, происходящих именно на второй, необратимой стадии. Кратко рассмотрим основные ииактивационные механизмы.
Агрегиране. Много често, с дългосрочна инкубация в далечината, при повишени температури, с екстремни стойности на рН
* Срок<кнеобратимость» по ей ношению к инактивации имеет t.което означава, че след отстраняването на експозицията на inactoanionnsho (например, е възможно да се намали температурата след 1 pod<мжнтельн^го нагревания) фермент не втвращается h иатнвной каталитически активной информации N. Он остается в неактивной форме 1 и в течение разумных времен наблюдения (часы. с\тки) ш- списобен само произвольно реактивироваться, т, е. перейти в форму N,"
в присъствието на химически денатуранти, протеини агрегат. Възможността за такова инактивация засяга редица фактори: температура, рН и др.; Въпреки това, концентрацията на протеина е решаваща сред тях. Тъй като кинетичният ред на уравнението, описващ етапа на агрегиране, е равен на или дори повече от два, след това естествено, увеличаването на протеиновата концентрация води до увеличаване на скоростта на агрегиране и размера на образуваните агрегати, както и ускоряване на инактивирането общо взето. Според тази характеризирана основа (силната зависимост на инактивирането на процеса върху концентрацията на ензима в разтвора е възможно да се разграничи кинетично агрегирането от мономолекулни инактивни механизми.
Като правило, протеинови агрегати се образуват поради слаби нековалентни взаимодействия, такива като хидрофобни взаимодействия, водородни връзки. Въпреки това, ако има SH-групи в протеинови молекули или по-нататък към тях повече S-8 връзки t, че индивидуалните молекули вътре в агрегатите могат да седнат със съвместно валентни дисулфидни мостове. Размерът и формата на не-колба или ковалентен-омрежните единици могат да варират значително до образуването на отделна фаза е протеиновото утаяване.
Промяна на първичната структура. Всички химични процеси, водещи до инактивиране на протеини, могат да бъдат разделени на две групи. Първият включва реакцията на счупване на пода и пептидния TSE-бъбрек т до второ - химическата модификация на отделните функционални групи протеин.
Хидролиза на пептидни връзки, протеолиза и автолиза. Не е каталитично растение от пептидни връзки в много сурови среди. По този начин, пълното разделяне на полипептидната верига в отделни компоненти на аминокиселините се постига само чрез дълготрайни (много часове) кипене на протеинов разтвор в концентрирана солна киселина. В малко повече "меки" условия, когато се нагряват протеинови разтвори при неутрално или слабо алкално рН и температура от 80-100 ° С, хидролизата на пептидните връзки също преминава само леко, или изобщо не се наблюдава. От всички пептидни връзки, най-лабилната до високотемпературна хидролиза, като правило, са тези, които са оформени от остатъците от аспарагинова киселина.
Обаче, хидролизата на пептидни връзки в протеини може да се появи при нормални условия - стайна температура, неутрални стойности на рН. Това е резултат от работата на протеазите - ензими, създадени по природа за разграждане на други протеини при меки условия. Тъй като протеиновите препарати могат да бъдат протеази като съпътстващи примеси във всички (дори високо пречистени) протеини, при изучаване на инактивиращи механизми е необходимо да се вземе предвид възможността за протеолиза. е.Друг пример за протеолитично инактивиране може да бъде бактериална инфекция на реактори, съдържащи ензими. Случайно влизат в клетките на микроорганизмите
Тайните протеази, които разделят ензим-биокатализаторните ензимни молекули. Използвайки "фрагментите" на протеолитичното разграждане като хранителна среда за растеж, микроорганизмите се размножават; Така, от една страна, реакторът е "опълзен", от друга страна, той намалява активността на биокатализатора в разтвора, т.е. те го итактиват.
Самите протеолитични ензими са в състояние да разделят не само молекулите на други протеини, но също така - този процес на "самоза шиене" протеази витолизано. От повечето други инактивационни механизми (с изключение на агрегацията) Autolis, можете да различите кинетични. Факт е, че основният етап в автолиза е образуването на комплекс между две молекули на компанията AZA; Този бимолекуларен етап често определя общата скорост на инактивиране. Следователно, ако при промяна на първоначалната концентрация на Протеа, има промяна в скоростта на инактивиране * Процесът на неактивиране отголяма вероятност е Autolis.
Окисляване на функционални групи на ензима. При повишени температури, някои функционални групи в протеини, и преди всичко от цистеиновата SH-група и фрагментите на студенницата на триптофан, са окислени. В резултат на окисление се образуват модифицирани производни на аминокиселини; цистеин сулфоксиони (SOH, SCW и др.), Разкриване на продукта Продукти на пръстена за долар на триптофан et al. В някои ензими, групи селф-водород, включени в активния център, имат увеличен реакционен капацитет и се окисляват дори и се окисляват дори при стайна температура.
Разделяне s- S-връзки в протеини.Разделянето може да се появи или в редуцираща среда (в присъствието на тиоли, други редуцирани серни съединения, такива като произход, Naacbh или в алкална среда при повишена температура. В първия случай продуктът за възстановяване на SS-комуникацията е неговата тиолова форма (протеин -SH) или смесени тиолови дисулфидни протеинови форми с регенериращ реагент (протеин -SR; протеин-SOR и т.н.). Когато алкално разделянето на SS-връзки PR! включва по-сложна верига от химични реакции. Първоначално , цистинът се хидролизира с образуването на дехидро-аланин:
i-CNCH.<^ + ОН ~ -* Csn-ch ^ s-s ~ + sn r \u003d с
което, като нуклеофил, взаимодейства с аминогрупите лизинови остатъци, сулфхидрилни групи от цистеинови остатъци, гуанидин групи от аргининови остатъци, образуващи нови аминокиселини, съответно, лисинанин, лантонин N орни-санолин:
soone h khon.
