Kuracie embryo Kuracie embryo
(CE) - kuracie embryo v rôznych štádiách embryonálneho vývoja. V mikrobiol. prax sa používa na izoláciu, kultiváciu a identifikáciu vírusov, rickettsie a niekedy aj baktérií. Na laboratórne účely vyberajte čerstvé, oplodnené, s dobre priesvitnou EC škrupinou bez prasklín. Inkubácia sa vykonáva v hniezdach trojnožky tupým koncom vajíčka nahor v dobre vetraných inkubátoroch alebo termostatoch pri teplote 37 - 37,5 ° C, relatívnej vlhkosti 63 - 65%. Na infekciu vyberte 4-13-dňové embryá s výraznými krvnými cievami, žĺtkovým vakom a pohyblivým tieňom. Pred infekciou sa vaječné škrupiny ošetria alkoholom, spália a v oblasti vpichu (zvyčajne nad vzduchovou komorou) sa namažú 2% jódovou tinktúrou. Materiál alebo výskum to-ru sa zavádza s otvorením alebo bez otvorenia škrupiny do žĺtkového vaku (rickettsia), do alantoidnej alebo amniotickej dutiny (väčšina vírusov), aplikuje sa na chorion-alantoidnú membránu. Menej často sa to-py vstrekuje do tela embrya alebo intravenózne. Infikované CE sa umiestnia do termostatu za podmienok a na obdobie, ktoré závisia od typu mikróbov a cieľov výskumu. Niektoré údaje o výsledkoch infekcie možno získať externým vyšetrením CE pod mikroskopom (cievna injekcia, strata pohyblivosti atď.). Vo väčšine prípadov sa však CE otvorí. Za týmto účelom sa po ošetrení alkoholom a jódovou tinktúrou odreže škrupina nad okrajom vzduchového vaku Pasteurovou pipetou alebo injekčnou striekačkou, najprv sa odsaje alantoická a potom plodová voda, aby sa nepoškodili cievy a žĺtok vak. Embryo a chorionallantoická membrána sa odstránia z obalu, umiestnia sa do sterilných misiek, premyjú sa sterilnou destilovanou vodou. vody a skúmať. Ďalší priebeh štúdia embrya a jeho tekutín závisí od typu mikróbu alebo vírusu a cieľov experimentu.
(Zdroj: Slovník pojmov z mikrobiológie)
Pozrite sa, čo je „kuracie embryo“ v iných slovníkoch:
EMBRYOTOXICITA- embryotoxicita, schopnosť fyzikálnych, biologických, chemických a iných činidiel negatívne pôsobiť na vyvíjajúce sa embryo. Embryotoxický účinok rôznych látok je potvrdený ich vystavením ženám ... ... Veterinárny encyklopedický slovník
Žiadosť kurčiat je presmerovaná sem; pozri aj iné významy. ? Domáce kura ... Wikipedia
Kurčatá Kurčatá sú ozdobou každého dvora Vedecká klasifikácia Kráľovstvo: Zvieratá Druh: Strunatci Trieda ... Wikipedia
Izolácia vírusov u laboratórnych zvierat.
Výber laboratórnych zvierat závisí od typu vírusu. Laboratórne zvieratá sú biologickým modelom. Niekedy je potrebné vykonať 3-5 „slepých“, asymptomatických pasáží, kým sa vírus prispôsobí laboratórnym podmienkam. Laboratórne zvieratá však nie sú vnímavé na niektoré vírusy, v tomto prípade sa musia použiť prirodzene vnímavé zvieratá. Ako napríklad mor ošípaných a infekčná anémia koní.
Účel infikovania laboratórnych zvierat:
1. Študovať patogenézu ochorenia;
2. Izolujte vírus z pat.materiálu;
3. Produkcia imunitného a hyperimunitného séra;
4. Výroba vakcín;
5. Udržiavanie vírusov v laboratórnych podmienkach;
6. Titrácia, aby sa určilo množstvo vírusu na jednotku objemu;
7. Biologický model nastavenia neutralizačnej reakcie;
Výber metódy na infikovanie laboratórnych zvierat závisí od tropizmu vírusu. Počas kultivácie neurotropných vírusov sa teda zvieratá infikujú do mozgu; respiračné intranosálne, intratracheálne; dermatropné - subkutánne a intradermálne.
Infekcia sa vykonáva v súlade s pravidlami asepsie a antiseptík.
Existuje mnoho spôsobov, ako vložiť očkovaný materiál do tela zvierat:
Subkutánne; - Intracerebrálne; - intradermálne;
intraperitoneálne; - intramuskulárne; - Vnútroočné;
intravenózne; - intranosálne; - stravovacie;
Po infekcii sa zvieratá označia, umiestnia do izolovaného boxu a sledujú sa 10 dní. Smrť zvieraťa v prvý deň po infekcii sa považuje za nešpecifickú a v budúcnosti sa s ňou nepočíta.
3 znaky naznačujú účinnosť infekcie:
Prítomnosť klinických príznakov
Smrť zvieraťa
Patologické zmeny (veľkosť, tvar, farba a konzistencia orgánu).
Kuracie embryá sú oplodnené vajce v ktorom sa vyvíja embryo (embryo). Kultivácia vírusov na embryách sliepok a prepelíc sa v poslednom čase rozšírila ako jedna z najjednoduchších a najspoľahlivejších metód na kultiváciu a diagnostiku mnohých vírusov a niektorých baktérií – brucella, rickettsia, vibrios.
Mnohé ľudské a zvieracie vírusy sú schopné kultivácie vo vývoji kuracích embryí. Embryonálne tkanivo, najmä embryonálna membrána, bohatá na tkanivá embryonálneho epitelu, je priaznivým prostredím pre množenie mnohých vírusov. Vírusy s epitelovými vlastnosťami (ovčie kiahne, ILT atď.) sa úspešne vyvíjajú na chorionalantoickej membráne, čo spôsobuje makroskopicky viditeľné zmeny. V embryu sa pri vstreknutí materiálu do alantoickej dutiny dobre množia rôzni zástupcovia mixovírusov (chrípka, pseudomor, mor mäsožravcov a pod.), vírusy infekčnej bronchitídy, kačiatkovej hepatitídy, arbovírusy atď. Niektoré vírusy sa úspešne kultivujú v žĺtkovom vaku.
výhody:
1. Nákladovo efektívne, okrem toho sú vajcia ľahko dostupné;
2. Vo vývoji kuracích embryí chýbajú obranné mechanizmy, pretože imunitný systém ešte nie je vyvinutý;
3. Škrupina vajec zabraňuje prenikaniu baktérií a vírusov cez ňu. životné prostredie;
Na kultiváciu a izoláciu vírusov na kuracích embryách je potrebné veľmi jednoduché vybavenie - obyčajný termostat alebo inkubátor.
Podmienky:
1. Vajcia sa získavajú z fariem, o ktorých je známe, že sú bezpečné z hľadiska infekčné choroby;
2. Kuracie embryá sa najlepšie získavajú z bielych plemien kurčiat (Leghorn, Russian White), pretože sú odolnejšie voči manipulácii a neumierajú na drobné poranenia. Okrem toho je ich škrupina biela a priehľadnejšia ako u iných plemien a je ľahšie viditeľná, čo je vhodné na prezeranie a pozorovanie pri práci s nimi;
3. Na inkubáciu vyberte oplodnené vajíčka znesené nie viac ako pred 10 dňami;
4. Berú nekontaminované vajíčka, keďže ich nie je možné pred inkubáciou umyť a špinavé vajíčka horšie presvitajú pri pohľade (ovoskopia) a pri práci s nimi môže dôjsť k infekcii embrya pri manipulácii;
Vajíčka sa inkubujú v inkubátore alebo v termostate s ohrevom vody a prístupom vzduchu a počas inkubácie v termostate je potrebné vajíčka 2-3x denne prevrátiť a pre lepšiu výmenu plynov vybrať na 5-10 minút do vzduchu. Na udržanie určitej vlhkosti je v termostate umiestnená nádoba s vodou na odparovanie, teplota v termostate by mala byť 38 °.
K vývoju embrya dochádza už v prvý deň inkubácie, dochádza k ukladaniu mozgu a kostry. Štruktúra kuracieho embrya vo veku 7-9 dní(pozri zošit).
Na infekciu sa najčastejšie používajú embryá vo veku 7-12 dní. Práca s kuracími embryami prebieha v sterilnom boxe s najprísnejším dodržiavaním asepsie.
Účel infikovania kuracích embryí:
1. Vyberte čiaru z materiálu vzoru;
2. Výroba vakcín;
3. Udržiavanie vírusu v laboratórnych podmienkach;
4. Titrácia vírusov;
5. Biologický model nastavenia neutralizačnej reakcie;
6. Štúdium interferencie vírusov a produkcie interferónu; Infekcia kuracích embryí:
Na infekciu musíte vybrať životaschopné embryá s dobre definovanou pohyblivosťou. Pred infekciou sú všetky embryá starostlivo vyšetrené v zatemnenej miestnosti na ovoskope.
Pri presvetlení embryí pred infekciou sa nakreslí pugu (vzduchová dutina), priebeh veľkých krvných ciev a miesto prezentácie embrya, teda oblasť na obale, kde embryo leží najbližšie k nej. škrupina jednoduchou ceruzkou. Znamienko puga, miesto prezentácie embrya a priebeh veľkých ciev potom slúžia ako vodítko pri výbere miesta vpichu očkovaného materiálu v čase infekcie.
Kuracie embryá vybrané na infekciu sa prenesú do boxu, kde s nimi pracujú. Pred infekciou sa škrupina v mieste zavedenia materiálu dvakrát ošetrí jódovaným alkoholom a vypáli. Dávka infekcie je 0,1-0,2 cm.
V závislosti od typu vírusu a účelu infekcie sú rôzne metódy zavádzania očkovaného materiálu:
1) Infekcia choriolantoickej membrány , embryá vo veku 7-12 dní sa používajú na izoláciu a kultiváciu neurotropných, dermatropných a niektorých pantropických vírusov (ovčie kiahne, encefalomyelitída, ILT, slintačka a krívačka, besnota, mor a pod.). Existujú 3 typy infekcií:
a) otvorte pogo a odrežte ho nožnicami, oddeľte škrupinovú membránu a naneste materiál na chorionalantoickú membránu (HAO). Otvor vo vajíčku sa potom utesní sterilným skleneným uzáverom a okraje uzáveru sa navoskujú;
b) vyrežte pilníkom (pilníkom) alebo vrúbkovaným skalpelom v škrupine trojuholník s dĺžkou strany asi 1 cm na okraji pugi zo strany prezentácie embrya, odstráňte časť škrupiny a pinzetou a vstreknite materiál. Otvor sa uzavrie sterilným skleneným krytom a okraje sa zavoskujú alebo zalepia sterilnou lepiacou páskou.
c) v mieste prezentácie embrya sa skalpelom odstráni malá oblasť škrupiny s plochou asi 0,5 cm, potom sa v tejto oblasti pomocou pinzety alebo ihly odstráni podškrupinová membrána a materiál sa vstrekuje. Ak materiál dobre nezapadá do dutiny vajíčka, môžete použiť gumenú žiarovku na odčerpanie vzduchu z poga cez otvor v škrupine na pogu a v dôsledku toho sa na mieste vytvorí umelý pogue zavádzania materiálu a potom sa materiál ľahko zavádza. Otvor v škrupine je uzavretý lepiacou náplasťou alebo voskovaný.
2) Infekcia do alantoickej dutiny. Táto metóda infekcie je veľmi jednoduchá a používa sa na izoláciu mnohých vírusov. Na infekciu sa odoberajú embryá staré 10-11 dní. Existujú dva typy infekcie:
a) infekcia sa prenáša cez mopslíka bez jeho odrezania. Ihlou odmerajte vzdialenosť od vrchu bogey po okraj bogey, označenú ceruzkou na plášti, a zapichnite ihlu do vyznačenej hĺbky a prehĺbte ešte 0,5 cm, aby ste prepichli chorionallantoickú membránu;
b) materiál sa vstrekuje ihlou cez vpich v škrupine v mieste prezentácie embrya do hĺbky 3-5 mm v avaskulárnej oblasti. Otvor v škrupine je uzavretý lepiacou náplasťou alebo voskovaný.
3) Infekcia v žĺtkovom vaku. Na infekciu sa používajú embryá staré 5-8 dní. Existujú dva typy infekcie:
a) ihla sa vloží zo strany mopslíka do žĺtkového vaku pod uhlom 45 ° k miestu prezentácie embrya pod kontrolou ovoskopu;
b) vajíčko sa umiestni na stojan aj embryom smerom nadol a ihla sa zasunie zhora nadol smerom k embryu do hĺbky asi 1 cm.
Miesto vpichu je utesnené lepiacou náplasťou a navoskované. 4) Infekcia do amniotickej dutiny. Pri tomto spôsobe infekcie môže vírus preniknúť do rôznych buniek, ktoré sú v kontakte s plodovou vodou, a množiť sa v nich. pre pohodlie infekcie sa odporúča inkubovať embryá 2-3 dni pred infekciou, so strachom nahor. Potom sa embryo a amnion pohybujú nahor a je pohodlnejšie infikovať. Existujú dva typy infekcie:
a) pogue sa otvorí a odreže, pinzetou sa odstráni obalová membrána a amnion sa zachytí, amnion sa stiahne pinzetou a materiál sa vstrekne do amniovej dutiny v dávke 0,1 ml. Otvor v plášti sa potom utesní sterilným skleneným uzáverom a okraje sa navoskujú;
b) infekcia dlhou ihlou cez pogu v tmavej miestnosti pod kontrolou oka.Ihla je predbežne ohnutá do pravého uhla, aby vytvorila malú oblasť. Ihla sa vsunie pod kontrolu oka cez zátku preembrya, pod tlakom tupej ihly sa embryo v tomto prípade pohne, potom sa amnion ľahkým zatlačením prepichne a ihla sa mierne potiahne späť. V tomto prípade by sa embryo malo pohybovať smerom nahor za ihlou. Potom sa zavádza materiál.
5) Infekcia v tele embrya a infekcia v mozgu. Používajú sa embryá staré 7-12 dní, infekcia sa uskutočňuje zavedením materiálu do rôznych častí tela alebo priamo do mozgu. Na infekciu sa pogue otvorí a embryo sa vytiahne pinzetou. Pri týchto spôsoboch infekcie môže smrť embryí v dôsledku traumy predstavovať až 30 % alebo viac z počtu infikovaných.
6) Infekcia do veľkých krvných ciev chorionallantoickej membrány. Táto metóda infekcie, rovnako ako predchádzajúca, sa používa veľmi zriedkavo. Materiál sa vstrekuje tenkou ihlou po odstránení obalu pozdĺž cievy priamo do cievy pozdĺž krvného obehu.
Po infekcii musia byť kuracie embryá označené jednoduchou ceruzkou a vložené do termostatu. Sledujú sa denne prezeraním, pozorovanie sa vykonáva až 7-8 dní v závislosti od typu vírusu. V prípade smrti embryí sa okamžite vyberú z termostatu a umiestnia sa do chladničky až do otvorenia. Ak embryo zomrelo počas prvých 14-18 hodín, môže to byť spôsobené traumou alebo toxicitou patologického materiálu. Preto, ako v prípade infekcie laboratórnych zvierat, sa v pochybných prípadoch odporúča urobiť niekoľko pasáží a odobrať niekoľko embryí pre každý materiál počas experimentu.
Pitva mŕtvych infikovaných kuracích embryí alebo embryí odstránených po období pozorovania sa vykonáva so všetkými pravidlami asepsie v sterilných podmienkach boxu. Pri otváraní sa škrupina ošetrí alkoholom a vypáli, potom sa pogue odreže. Pri otvorenom embryu sa najskôr opatrne odsaje alantoidná tekutina (jej množstvo je asi 7 ml), potom sa pinzetou stiahne plodová membrána, prepichne Pasteurovou pipetou a odsaje sa plodová voda (jej množstvo je 1,0-1,5 ml). ), potom sa odoberie žĺtok, odstránia sa membrány a embryo. Tekutina, membrány a samotné embryo sa starostlivo skúmajú na zmeny. Plodová voda je normálne úplne priehľadná, pri infekcii môže byť zakalená, krvavá. Charakteristické zmeny spôsobené vírusom sú najvýraznejšie na chorionallantoickej membráne: objavujú sa zápalové ložiská, nepriehľadné, okrúhle a krvácania. Krvácanie môže byť na tele embrya. Všetok materiál sa zhromažďuje v sterilnej nádobe.
Kuracie embryá vo virológii sa široko používajú nielen na izoláciu vírusov, ale aj na akumuláciu a získanie antigénov, na prípravu živých a usmrtených vakcín, titráciu vírusov, na stanovenie vírusovej neutralizačnej reakcie, na zoslabenie (oslabenie) vírusov, na štúdium interferencie vírusy a získavanie interferónu ...
Kuracie embryá sú veľmi lacným a pohodlným systémom na kultiváciu vírusov chrípky. Takmer všetky kmene vírusov ľudského aj zvieracieho pôvodu sa v embryách množia v tej či onej miere. Laboratórne kmene, ktoré sú najlepšie prispôsobené tomuto systému, poskytujú dostatočne vysoké titre v embryách alebo 10-10 pfu na embryo). Okrem toho je embryo izolované z vonkajšieho prostredia, a preto vírus nepotrebuje vytvoriťšpeciálne sterilné podmienky.
Vírus sa zvyčajne vstrekuje do alantoidnej dutiny vajíčka naplnenej tekutinou, odkiaľ môže vstúpiť do chorionallantoickej membrány a infikovať bunky, ktoré ju tvoria. Vírusové potomstvo vstupuje do alantoickej tekutiny a môže byť ľahko odstránené z vajíčka odsatím tejto tekutiny. Niektoré kmene v najmä nové prírodné izoláty, ako aj vírusy typu S reprodukujú sa zle na chorio-callantoickej membráne, ale množia sa, keď sa vstrekujú priamo do amniotickej dutiny; vírus získa prístup k rôznym tkanivám embrya a výsledné potomstvo sa uvoľní do plodovej vody, ktorú je možné samostatne odstrániť.
Vírus sa najlepšie reprodukuje v 10 až 12-dňových embryách. Čerstvo oplodnené vajíčka by sa mali kúpiť a podľa potreby inkubovať v laboratóriu. Na to nie je potrebné mať špeciálne vybavenie, ale inkubátor je veľmi pohodlný. Vajíčka je však možné úspešne inkubovať v klasickom inkubátore vo vlhkej atmosfére pri teplote 37 °C, ak sú pravidelne prevracané. Stupeň vajec nemá osobitného významu, ale v niektorých prípadoch je dôležité vylúčiť možnosť kontaminácie vajíčka inými mikroorganizmami; niektorí predajcovia predávajú špeciálne nekontaminované vajcia.
Pred infekciou sa uistite, že vajíčka sú skutočne oplodnené. Na to stačí preskúmať vajíčko v blízkosti zdroja jasného svetla v tmavej miestnosti. 4-5 dní po oplodnení by malo byť embryo jasne viditeľné.
Pri štandardnom pasážovaní laboratórnych kmeňov je vírusové inokulum zvyčajne vzorkou infikovanej alantoickej alebo kultivačnej tekutiny. Vzorky sa pred použitím spravidla zriedia Hanksovým fyziologickým roztokom na koncentráciu vírusu 10-10 pfu / ml, pretože zavedenie veľkého množstva vírusu do vajíčka podporuje tvorbu HDV. Ak sa zriedený vírus musí pred infekciou skladovať, potom by sa do riediaceho roztoku mala pridať želatína. Prirodzene je potrebné zabezpečiť sterilitu vírusu použitého na infekciu; v prípadoch, keď je to ťažké, sa do inokula pridáva antibiotikum gentamicín.
Tieto metódy zahŕňajú použitie homogenizácie na mletie vzoriek, nízkorýchlostnú centrifugáciu na ich vyčírenie a zavedenie neriedeného supernatantu do amniotickej dutiny.
Infekcia embryí.
I. Zavedenie vírusu do alantoickej dutiny
- 1. Vajcia sú položené na ich boku a trené na vrchole s alkoholom sterilizácia oblasť okolo miesta infekcie.
- 2. Pomocou zubnej vŕtačky s rezným kotúčom sa v plášti vytvorí malý otvor. Otvor musí byť dostatočne hlboký, aby bolo možné vpichnúť ihlu pre injekciou, ale je vhodné nepoškodiť vnútornú membránu škrupiny.
- 3. Injekčnou striekačkou s ihlou č. 25 sa do alantoidnej dutiny naočkuje 0,1 ml vírusu, pričom ihla sa zavedie priamo pod plášť.
- 4. Otvor v škrupine je utesnený malým množstvom roztaveného vosku.
- 5. Infikované vajíčka sa inkubujú v termostate vo vlhkej atmosfére špičkou nadol. Počas inkubácie nie je potrebné vajíčka otáčať.
II. Zavedenie vírusu do amniotickej dutiny
- 1. Tupý koniec vajíčka sa sterilizuje potretím alkoholom a vytvorí sa malý otvor, ako je znázornené na obrázku.
- 2. Vajíčko sa umiestni do blízkosti zdroja jasného svetla v tmavej miestnosti, aby bolo embryo viditeľné.
- 3. Ihla č. 23, dlhá 4 cm, sa vloží do vytvoreného otvoru a potom sa ostrým pohybom v smere embrya - do amniotickej dutiny. Súčasne sa zavedie 0,1 ml vírusu a ihla sa opatrne odstráni.
- 4. Otvor v škrupine sa utesní roztaveným voskom a vajcia sa inkubujú ako je uvedené vyššie.
Inkubačný čas.
Optimálny inkubačný čas potrebný na získanie maximálneho výťažku vírusu závisí od konkrétneho kmeňa a musí sa určiť experimentálne. V prípade niektorých kmeňov vírusu chrípky A, napríklad vírusu moru hydiny, sa maximálny výťažok dosiahne po 24 až 26 hodinách, zatiaľ čo väčšina kmeňov vírusu ľudskej chrípky A, ako aj vírusy typu B a S vyžadujú 48-72 hodín inkubácie.
Zhromažďovanie vírusu.
Pred pokusom o extrakciu vakcinovanej tekutiny z vajíčka sa odporúča schladiť vajíčko 4-18 hodín pri 4 °C alebo 30 minút pri -20 °C. Po ochladení embryo odumiera a okolité cievy sa zužujú. Výrazne sa tak znižuje možnosť kontaminácie očkovanej tekutiny erytrocytmi, ktoré môžu naviazať časť vírusu a tým znížiť jeho produkciu. Ak sa stále nedá vyhnúť kontaminácii erytrocytmi, stratu vírusu možno minimalizovať inkubáciou materiálu počas 30 minút pri 37 °C. Za týchto podmienok viriónová neuraminidáza ničí receptory erytrocytov, na ktoré sa vírus viaže, a uvoľňuje sa.
I. Odber alantoickej tekutiny
- 1. Vajcia dáme na stojan tupým koncom nahor a povrch sterilizujeme alkoholom.
- 2. Tupý koniec vajíčka sa otvorí buď pomocou sterilných klieští, alebo pomocou špeciálneho zariadenia. Škrupina okolo vzduchového vaku sa odstráni, čím sa odkryje alantoická dutina.
- 3.Pomocou sterilných tupých klieští roztrhnite chorionallantoickú membránu a zatlačte ju na okraj vajíčka.
- 4. Embryo a žĺtkový vačok sa jemne zatlačí pinzetou a alantoidná tekutina sa odsaje pomocou pipety so širokým koncom. Zo stredne veľkého vajíčka sa získa 7-10 ml svetložltej tekutiny. Prímes žĺtka v alantoickej tekutine narúša ďalšie čistenie vírusu, preto výber malo by sa zabrániť poškodeniu žĺtkového vaku. Ak je vírus určený na biochemické štúdie, napríklad na analýzu aktivity viriónových enzýmov, alantoická tekutina by sa mala odoberať pri 0 ° C.
- 5. Alantoická tekutina sa vyčíri centrifugáciou počas 10 minút pri 10 000 g a supernatant skladujte pri teplote 4 alebo -70 °C.
II. Odber plodovej vody
- 1. Povrch vajíčka sa sterilizuje a tupý koniec sa otvorí, ako je opísané vyššie. Odstráňte čo najväčšiu časť škrupiny, aby sa obsah vajíčka dal ľahko odstrániť.
- 2. Chorionallantoická membrána sa pretrhne a obsah vajíčka sa vyleje do sterilnej Petriho misky. V tomto prípade musí amniotická dutina zostať neporušená.
- 3. S Pomocou injekčnej striekačky s ihlou č. 25 sa obsah z amniotickej dutiny vytiahne čo najúplnejšie.
- 4. Plodová voda sa číri a skladuje rovnakým spôsobom ako alantoická tekutina.
Očakávaný výstup.
Intenzita množenia vírusu v embryách závisí od konkrétneho kmeňa. Divoké kmene spočiatku dávajú veľmi nízke titre, ale po niekoľkých pasážach v embryách sa titer výrazne zvýši. Pre rôzne laboratórne kmene prispôsobené na reprodukciu na embryách sa výťažok tiež výrazne líši, ale vo väčšine prípadov sa v alantoickej tekutine akumuluje 2 000 - 5 000 a niekedy až 20 000 HAU / ml vírusu. Je zrejmé, že adaptácia na reprodukciu u embryí je spojená S výber genetických variantov, tak by ste mali mať v vzhľadom na skutočnosť, že výsledky podrobnej genetickej a biochemickej štúdie kmeňov pasážovaných na embryách nemusia nevyhnutne charakterizovať pôvodný izolát.
Účel lekcie
Oboznámiť študentov s metódami selekcie kuracích embryí na kultiváciu vírusov.
Vybavenie a materiály
Kuracie embryá vo veku 9-12 dní inkubácie, ovoskop, alkoholové tampóny, stojany na embryá, pinzeta, nožnice, náplasti, ihly, striekačky, ceruzky, dierovače, ihly, tabuľky, schémy, multimediálne vybavenie, prezentácie MS Office Power Point na tému lekcie.
Metodika vedenia vyučovacej hodiny a usmernenia na túto tému
Vysvetlenie učiteľa
Kultivácia vírusov na kuracích embryách je najdostupnejšou a najpohodlnejšou metódou na primárnu izoláciu vírusu. Prax používania tejto metódy infekcie ukázala množstvo výhod oproti iným metódam. Na infekciu sa používajú embryá 5 až 12 dní inkubácie.
VÝHODY A NEVÝHODY kuracích embryí AKO BIOLOGICKÝCH OBJEKTOV
Kultivácia vírusov v kuracích embryách je najdostupnejšou a najpohodlnejšou metódou tak na primárnu izoláciu vírusov z chorých zvierat a z objektov prostredia, ako aj na následnú kultiváciu vírusov v laboratóriu. Táto metóda je široko používaná na identifikáciu vírusov a protilátok, ako aj na prípravu vakcín a diagnostiku. Aplikačná prax ukázala množstvo výhod tejto metódy oproti kultivácii vírusov na laboratórnych zvieratách. Je známe, že v blízkosti sa môžu spontánne infikovať biele myši, ktoré sú široko používané vo virologickom výskume vírusové infekcie: ektromélia, lymfocytová choriomeningitída, Taylorova encefalitída, vírusová pneumónia, Sendai vírus a iné, čo mimoriadne komplikuje prácu a často vedie k chybným záverom pri hodnotení získaných výsledkov. Kultivácia vírusov na kuracích embryách do značnej miery odstraňuje uvedené ťažkosti. Spolu s tým z kuracieho embrya môžete výrazne získať veľká kvantita vírus než z laboratórnych zvierat. Kuracie embryo má väčšiu životaschopnosť a odolnosť voči rôznym druhom vplyvov, ktoré sú nevyhnutné pri zavádzaní testovaného materiálu. Pri známej zručnosti práce s embryami a dodržiavaní pravidiel asepsy je ich smrť bezvýznamná. Najväčšia strata embryí nastáva pri zavedení materiálu do plodovej dutiny a žĺtkového vaku, ale ani v týchto prípadoch nepresahuje 10-15%, ak sú splnené potrebné inkubačné podmienky.
Kuracie embryá ako živý systém vstúpili do virologickej praxe v 30-tych rokoch XX storočia. Ich použitie rozšírilo škálu vírusov kultivovaných v laboratórnych podmienkach, umožnilo úspešnejšie riešiť problémy, ktorým čelí virológia, pretože kuracie embryá majú oproti laboratórnym zvieratám množstvo výhod: 1) škrupina a membrána škrupiny spoľahlivo chránia embryo z bakteriálnej infekcie z vonkajšieho prostredia; 2) dôležitou výhodou embryí je aj ich vysoká citlivosť na široké spektrum vírusov, čo sa vysvetľuje nedostatočným vyvinutím obranných mechanizmov; 3) kuracie embryá sú ľahko dostupným objektom vďaka rozvoju širokej siete hydinových fariem a liahní; 4) kuracie embryá sú ekonomické, nevyžadujú starostlivosť a kŕmenie.
Hlavné nevýhody sú: 1) nemožnosť úplne zaručiť sterilitu tohto živého systému, keďže embryá môžu vo svojom obsahu niesť vírusy a iné patogénne agens (vírusy infekčnej bronchitídy kurčiat, pseudomor, chrípku, leukémiu, chlamýdie a mykoplazmy) . Ich prítomnosť môže skresliť výsledky štúdie; 2) kuracie embryá nie sú citlivé na všetky vírusy.
ÚČELY POUŽITIA KURACÍCH EMBRYÍ
Kuracie embryá sa vo virológii používajú hlavne na rovnaké účely ako laboratórne zvieratá, a to:
- detekcia aktívneho vírusu v patologickom materiáli biotestom;
- primárna izolácia vírusu. Vírusy, ktoré spôsobujú choroby vtákov, ako aj niektoré vírusy cicavcov sú účinne izolované a kultivované na kuracích embryách;
- udržiavanie vírusov v laboratóriu;
- titrácia vírusov;
- nahromadenie vírusu pre laboratórny výskum a získavanie vakcín;
- ako skúšobný objekt v neutralizačnej reakcii.
POŽIADAVKY NA KURACIE EMBRYO
Vajcia musia byť získané z fariem bez vírusových ochorení. V oplodnených vajíčkach, dokonca aj od klinicky zdravých kurčiat, sa môžu u týchto vtákov nachádzať rôzne vírusy: pseudomor, infekčná bronchitída, infekčná laryngotracheitída, encefalomyelitída, parainfluenza-2, polyartritída, kiahne, arbovírusy, adenovírusy atď. Prítomnosť týchto vírusov môže na jednej strane viesť k diagnostickým chybám a na druhej strane na základe javu interferencie k potlačeniu množenia vírusu v testovanej vzorke. Embryá, ktoré neobsahujú vírus, ale sú získané z kurčiat asymptomaticky infikovaných určitými vírusmi, môžu byť tiež menej citlivé alebo úplne necitlivé na pôsobenie tohto vírusu v dôsledku prítomnosti špecifických protilátok získaných od matky so žĺtkom. Pre úspešnú izoláciu vírusu je potrebné, aby kurčatá, ktorých embryá sa využívajú v práci, neboli očkované proti chorobe, ktorej pôvodca sa hľadá. Škrupina vajec musí byť nepigmentovaná, čistá (neumývaná). Vek embrya musí zodpovedať zvolenému spôsobu infekcie.
Na zabezpečenie normálneho vývoja embryí v oplodnených vajíčkach je potrebné počas inkubačnej doby dodržiavať určitú teplotu a vlhkosť. Vyvíjajúce sa embryá znášajú prehriatie oveľa horšie ako ochladzovanie. Krátkodobá (do niekoľkých hodín) porucha vykurovacieho systému preto veľa neškodí. Pri dlhších prestávkach je potrebné zahriatie.
Inkubované vajíčka potrebujú voľný prístup čerstvý vzduch, ktorý vstupuje cez prieduchy. Mali by byť vždy otvorené. Jedno vajce, ako sa bežne verí, spotrebuje 1 liter kyslíka denne, čo nie je prekvapujúce, ak si spomeniete na rýchly vývoj embrya počas 21 dní inkubácie. Preto sa vajíčka nedajú ukladať vedľa seba, ako aj jedno na druhé. Bežné termostaty nie sú vhodné na inkubáciu vajec. Na tieto účely ich možno použiť len v nevyhnutných prípadoch, no zároveň často vetrať a dať dovnútra nádobu s vodou, aby sa zabezpečila požadovaná vlhkosť.
Vajíčka znesené na inkubáciu sa osvetlia o 3 až 5 dní pomocou špeciálnej stolovej alebo ručnej lampy (ak sa vajíčka nevyberú z podnosu inkubátora), aby sa vybrali neoplodnené. Leghorn vajcia sú najvhodnejšie na virologickú prácu, pretože ich tenká biela škrupina umožňuje lepšie vidieť obsah. Neoplodnené vajíčka alebo vajíčka obsahujúce mŕtve embryá sa z inkubátora odstránia. Podiel oplodnených vajíčok sa značne líši v závislosti od mnohých faktorov vrátane ročného obdobia: na jar je najvyšší, v zime najnižší.
Druhýkrát sú embryá priesvitné v deň plánovanej infekcie. Toto obdobie závisí od typu vírusu, ako aj od cesty jeho zavedenia. Miesto infekcie je vyznačené na škrupine obyčajnou (nie atramentovou) ceruzkou.
ŠTRUKTÚRA KURACIEHO EMBRYA
Zvyčajne sliepka znesie oplodnené vajíčko, v ktorom je embryo v štádiu blastuly alebo skorej gastruly. Keď sa vajíčko zahreje na teplotu blízku teplote tela sliepky, embryo sa ďalej vyvíja (obr. 15). V období od 5. do 12. dňa inkubácie môžu byť kuracie embryá použité na infekciu vírusmi.
Obrázok 15 - Schematický rez kuracieho embrya na 8. deň inkubácie: 1 - škrupina; 2 - škrupina; 3 - chorionallantoická membrána; 4 - alantoická dutina; 5 - žĺtkový vak; 6 - proteín; 7 - vzduchová komora; 8 - telo embrya; 9 - plodová dutina
Vajíčko s vyvíjajúcim sa kuracím zárodkom je zvonku pokryté tvrdou, pórovitou škrupinou, ku ktorej je tesne pripojená škrupinová membrána. Ten je na tupom konci vajíčka rozdelený na dva listy, medzi ktorými je vytvorená vzduchová komora. Telo embrya leží vo vajci excentricky, chrbtom bližšie k škrupine, hlavou smerujúcou k vzduchovej komore. Embryo je ponorené do plodovej vody, ktorá vypĺňa plodovú dutinu, a pupočná šnúra je spojená so žĺtkom. Žĺtok je tiež umiestnený excentricky a relatívne k embryu, ako to bolo, na druhej strane pozdĺžnej osi.
Priamo pod škrupinovou membránou je alantoidná dutina, ktorá pokrýva amnion a žĺtkový vak, a na 10-11 deň sa uzavrie na ostrom konci vajíčka. V procese vývoja alantoická membrána rastie spolu s chorionom a vytvára jedinú chorionallantoickú membránu (CAO). Na ostrom konci vajíčka je zvyšok bielkovín.
Infekcia v jednej alebo druhej časti embrya sa uskutočňuje počas obdobia jeho maximálneho vývoja, keď bude počet citlivých buniek najväčší.
V procese inkubácie sa veľkosť embryonálnych štruktúr mení, čo je do značnej miery spôsobené ich funkčným účelom a určuje optimálny vek embrya na infekciu.
Takže žĺtkový vak ako rezervoár živiny má najväčší objem na začiatku inkubácie a potom (po 12. dni), ako sa embryo vyvíja, klesá. Infikované do žĺtkového vaku od 5. do 7. dňa inkubácie.
Plodová dutina, ktorá je tlmivým prostredím pre vývoj embrya, ho pokrýva už na 5. deň inkubácie. Priemerné množstvo tekutiny v strede inkubačnej doby je asi 1 ml.
Na infekciu v amniovej dutine sa používajú embryá vo veku 6-10 dní.
Alantoická dutina slúži na zber produktov látkovej premeny, hromadia sa v nej soli kyseliny močovej, fosfor a dusíkaté zlúčeniny. Počas rastu a vývoja embrya získava alantoická tekutina kyslú reakciu. Alantoidná dutina dosahuje svoju maximálnu veľkosť na 9-12 deň vývoja embrya, preto sa infekcia v alantoidnej dutine uskutočňuje hlavne v 9.-11. deň inkubácie.
Chorionallantoická membrána je bohatá na krvné cievy, ktoré tesne priliehajú k vnútornému povrchu poréznej škrupiny, sú nasýtené kyslíkom a zásobujú ich telo embrya, pričom vykonávajú funkciu dýchacieho orgánu embrya. KhAO dosiahne svoj maximálny rozvoj na 11-13 deň. Infekcia na chorionallantoickej membráne sa uskutočňuje 10. až 12. deň inkubácie.
PRÍPRAVA kuracích embryí NA INFEKCIU
Embryá sa prepravujú z liahne bez toho, aby boli počas cesty chladené. V laboratóriu sa embryá inkubujú v termostate pri teplote 37°C a vlhkosti 60-70%, čo sa dosiahne nastavením otvorených nádob so širokým hrdlom s vodou v termostate. Vetracie otvory termostatu musia byť otvorené. Embryá sa umiestnia vzduchovou komorou nahor do špeciálnych stojanov. Odporúča sa nechať embryá adaptovať sa na nové podmienky a normalizovať ich funkcie po transportnom strese až do momentu infekcie. Ak má laboratórium vlastnú liaheň, tak oplodnené vajíčka znesené sliepkou sú vhodné na znášanie do nej 10 dní.
Príprava kuracích embryí na infekciu zahŕňa ovoskopiu a dezinfekciu škrupín, ako aj vhodnú prípravu pracoviska. Ovoskopia zahŕňa pozorovanie vajíčok proti dostatočne jasnému zdroju svetla (ovoskop), čo vedie k tieňom z vnútorných štruktúr na neosvetlenej strane škrupiny (obrázok 16). Ovoskopia sa vykonáva v tmavej miestnosti. Zároveň je na plášti grafitovou ceruzkou vyznačené ohraničenie vzduchovej komôrky, umiestnenie embrya a úsek avaskulárnej zóny s veľkosťou 0,5x0,5 cm.Tieto značky slúžia ako vodidlo. pri výbere miesta vpichu očkovaného materiálu. Pri ovoskopii sa zisťuje aj to, či je embryo živé alebo odumreté. Embryá vykazujúce aktívne pohyby s dobrým krvným obehom v krvných cievach CAO sa považujú za živé.
Obrázok 16 - Ovoskopia kuracieho embrya na 10. deň inkubácie. Sú viditeľné tiene: 1 - embryo; 2 - žĺtkový vak; 3 - krvné cievy HAO; 4 - vzduchová komora; 5 - veverička
Kuracie embryá sa infikujú asepticky (najlepšie v krabici). V predboxe sa obal embrya ošetrí jódovaným liehom, potom sa v krabičke opäť utrie a niekedy aj flambuje - ošetrí sa plameňom tampónu navlhčeného v alkohole.
Embryá sú fixované v špeciálnych stojanoch inštalovaných v smaltovanej kyvete na 3-4-vrstvovej gázovej obrúske navlhčenej dezinfekčným roztokom.
Používajú varné sterilizované nástroje. Pred každým opätovným použitím sa umiestnia do pohára s alkoholom a spália plameňom horáka.
Demonštrácia
a) klinické príznaky choroby u infikovaných laboratórnych zvierat; b) metódy usmrcovania laboratórnych zvierat; c) techniky pitvy (upozorniť študentov na stav vnútorné orgány) a spôsoby získavania očkovaného materiálu; d) techniky na vytváranie odtlačkov mozgu; e) úkony na dekontamináciu pracoviska a mŕtvoly po otvorení infikovaného zvieraťa.
Úlohy
1. Študovať štruktúru kuracieho embrya.
2. Vykonajte ovoskopiu kuracieho embrya, určte jeho životaschopnosť a označte hranice tieňov prírodných útvarov.
3. Pripravte kuracie embryá na infekciu.
Samostatná práca študentov
a) rozpoznanie podľa farebného znaku myší infikovaných každým zo študentov, rozbor ich klinického stavu, usmrtenie, fixácia v kyvete s voskovým (parafínovým) dnom, otvorenie; b) rozbor patologických zmien, získanie očkovaného materiálu (parenchýmových orgánov), príprava vrstvených odtlačkov mozgu.
Študenti vykonávajú ovoskopiu kuracieho embrya, určujú jeho životaschopnosť a označujú hranice tieňov prírodných útvarov.
Zhrnutie výsledkov lekcie
Úloha na ďalšiu lekciu
Kontrolné otázky
1. Štruktúra kuracieho embrya.
2. Na čo slúžia kuracie embryá vo virológii?
3. Aká je štruktúra vyvíjajúceho sa kuracieho embrya?
Odkedy sa zistilo, že vírusy chrípky sa množia v kuracích embryách, táto metóda sa stala široko používanou vo virológii, pretože sa ľahko používa a nie je drahá.
Používajú sa kuracie embryá staré 7-9 dní (celý vývojový cyklus je 21 dní).
Pred infekciou sa povrch ošetrí alkoholom, roztokom jódu, v škrupine sa vytvorí otvor a infikuje sa sterilnou injekčnou striekačkou.
Spôsoby infekcie: do amniovej dutiny, do alantoidnej dutiny alebo do žĺtkového vaku. Vírusy sa množia na zodpovedajúcich membránach, hromadia sa v dutine tekutiny, ktorá sa potom môže zbierať na ďalší výskum.
Embryá sa kultivujú pri 37 stupňoch. 3 dni, potom sa škrupina znova spracuje, embryo sa otvorí sterilnými nástrojmi a odoberie sa vakcinovaná tekutina. Všetky práce na infekcii a pitve sa vykonávajú v krabici.
Kultivácia na bunkových kultúrach.
Bunkové kultúry sa vo virológii začali používať v posledných desaťročiach, čo umožnilo kultivovať a študovať oveľa širšiu škálu vírusov, keďže nie všetky ľudské vírusy je možné izolovať u zvierat alebo embryí. Moderná virológia teda využíva bunkové kultúry, ktorých sa získalo veľmi veľa.
Odrody bunkových kultúr
a) primárne - získané z embryonálneho tkaniva jeho rozdrvením, spracovaním s trypsínom na disagregáciu (separáciu) buniek a ďalšiu kultiváciu
in vitro v špeciálnej kultivačnej tekutine.
b) transplantované- získané z nádorového tkaniva, líšia sa tým, že sa dajú neobmedzene kultivovať, pričom sa mení len kultivačné médium a misky.
V procese kultivácie sa na skle získava monovrstva : teda jedna vrstva buniek.
Teraz môžete tieto bunky infikovať testovaným materiálom domnelým vírusom alebo už existujúcimi vírusmi. Misky s bunkami, infikovanými a neinfikovanými, sa kultivujú v termostate pri 37 stupňoch.
Proces akumulácie viriónov v bunkovej kultúre trvá približne 48 - 72 hodín.
Výberom vhodných plodín možno kultivovať prakticky všetky ľudské vírusy.
Ďalšou etapou štúdie je indikácia a identifikácia vírusov.
Indikačné metódy.
Indikácia - ide o detekciu vírusov priamo v testovanom materiáli alebo v kultivačnej tekutine alebo v infikovaných bunkách.
I. Ak sú virióny v kvapaline, potom ich možno detegovať pomocou hemaglutinačnej reakcie.
Podstata reakcie: niektoré typy vírusov sú schopné spontánne zlepiť (to znamená spôsobiť hemaglutináciu) akékoľvek erytrocyty. Napríklad chrípkové virióny zlepujú kuracie erytrocyty, niektoré adenovírusy - potkanie erytrocyty atď.
Pomocou suspenzie erytrocytov vo fyziologickom roztoku sa teda môžu vírusy detegovať vo vakcinovanej tekutine.
II. Ak sa vírusy množia v bunkovej kultúre, ale sú hemaglutinujúce, možno ich detegovať pomocou hemadsorpčnej reakcie: suspenzia erytrocytov sa nanesie na kultúru, inkubuje sa, vysuší - ak je kultúra infikovaná, erytrocyty priľnú priamo ku kultúre. infikované bunky - to je možné vidieť pod svetelným mikroskopom.
III.Iné účinky:
a) vírusy spôsobujú deštrukciu monovrstvy – nazýva sa to cytopatogénny účinok vírusu – CPP.
b) spôsobujú vírusy morfologické zmeny bunky: intracelulárne alebo intranukleárne inklúzie, tvorba syncýtia, sympplastov (čiže splynutie viacerých buniek do jedného útvaru v dôsledku poškodenia bunkových membrán).
